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動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第1篇

題目：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在動(dòng)物疫病及動(dòng)物產(chǎn)品上的應(yīng)用

摘要：通過(guò)對(duì)近年來(lái)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)在動(dòng)物疫病和動(dòng)物產(chǎn)品上的應(yīng)用情況的研究，從國(guó)內(nèi)外兩個(gè)方面進(jìn)行闡述，綜述了國(guó)外風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系及應(yīng)用現(xiàn)狀和國(guó)內(nèi)的應(yīng)用進(jìn)展，并針對(duì)我國(guó)目前風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系建設(shè)情況提出了相應(yīng)的建議。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)在動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品上的應(yīng)用主要包括動(dòng)物疾病的檢測(cè)和預(yù)警以及動(dòng)物產(chǎn)品的加工過(guò)程的監(jiān)控。

關(guān)鍵詞：沙門疫病動(dòng)物

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是系統(tǒng)地采用一切科學(xué)技術(shù)及信息，在特定條件下，對(duì)動(dòng)物、植物和人類或環(huán)境暴露于某危害因素產(chǎn)生或?qū)a(chǎn)生不良效應(yīng)的可能性和嚴(yán)重性的科學(xué)評(píng)價(jià)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)在國(guó)外動(dòng)物疫病控制和食品安全方面得到了廣泛系統(tǒng)的發(fā)展和應(yīng)用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2002年成立了動(dòng)物疫病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估小組，依據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)的有關(guān)規(guī)定對(duì)中國(guó)動(dòng)物疫病進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，在2009年6月正式實(shí)施的《中華人民共和國(guó)食品安全法》提出了加強(qiáng)食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系建設(shè)。近年來(lái)，我國(guó)在動(dòng)物疫病和食品安全方面初步建立了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系，盡管在某些方面取得了一定的成績(jī)，但是在技術(shù)上和應(yīng)用程度上都與發(fā)達(dá)國(guó)家存在很大差距。

1 發(fā)達(dá)國(guó)家建立了重大動(dòng)物疫病控制系統(tǒng)

在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，口蹄疫、藍(lán)舌病、非洲豬瘟、牛海綿狀腦病、高致病性禽流感等傳染病的監(jiān)測(cè)中都有風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的研究。許多發(fā)達(dá)國(guó)家都建立了重大動(dòng)物疫病控制系統(tǒng)，不僅為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供大量真實(shí)的數(shù)據(jù)，而且可以通過(guò)與地理信息系統(tǒng)(Geographic information system，GIS)技術(shù)的結(jié)合，對(duì)疫病的發(fā)生進(jìn)行預(yù)警，從而判斷和控制動(dòng)物和人群中疾病的發(fā)生，大大降低了由動(dòng)物疫病帶來(lái)的各方面損失 [1]。如荷蘭通過(guò)對(duì)574個(gè)家禽飼養(yǎng)場(chǎng)進(jìn)行禽流感的風(fēng)險(xiǎn)因素調(diào)查發(fā)現(xiàn)，禽流感的傳播與禽舍的類型和周圍是否飼養(yǎng)其他動(dòng)物的關(guān)系不大，而飼養(yǎng)場(chǎng)之間的蛋托和蛋箱的使用會(huì)增加禽流感傳播風(fēng)險(xiǎn) [2]。Andraud M和RoseN等 [3-5]在2010建立了豬圓環(huán)病毒病在豬場(chǎng)中傳播的風(fēng)險(xiǎn)分析模型，該模型是個(gè)體動(dòng)物為基礎(chǔ)產(chǎn)生隨機(jī)模型與豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)的流行病學(xué)動(dòng)力學(xué)模型的結(jié)合，所涉及的主要參數(shù)來(lái)自于2008年發(fā)表的感染試驗(yàn)的論文，該論文是對(duì)豬圓環(huán)病毒在窩內(nèi)及窩與窩之間進(jìn)行傳播的各種相關(guān)參數(shù)定量確定 [6]。而在2009年，Rose N等 [7]用以連續(xù)清楚的過(guò)程展現(xiàn)了風(fēng)險(xiǎn)分析在規(guī)模化豬場(chǎng)上的引用。首先采用豬場(chǎng)實(shí)地調(diào)研確定了豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)在豬場(chǎng)傳播的風(fēng)險(xiǎn)因素，確定了在豬場(chǎng)管理中疫苗免疫的重要性，將它作為重要因素放入個(gè)體動(dòng)物的動(dòng)態(tài)隨機(jī)模型中。再通過(guò)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)因素的確定，各種試驗(yàn)確定相應(yīng)的模型參數(shù)，制定最后的數(shù)學(xué)模型。Katharina D C等 [8]在2002年做的一個(gè)假設(shè)，豬由于飼喂進(jìn)口受污染的飼料使豬發(fā)生感染的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，該評(píng)估構(gòu)建了豬暴露于受污染飼料的概念模型圖。

新西蘭農(nóng)林部動(dòng)物生物安全機(jī)構(gòu)的有關(guān)專家，對(duì)口蹄疫傳入新西蘭進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。新西蘭主要?jiǎng)游镆卟】刂葡到y(tǒng)是EpiMAN，系統(tǒng)最初開(kāi)始實(shí)施于口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)，疾病由空間數(shù)據(jù)、文本數(shù)據(jù)和流行病學(xué)的知識(shí)組成數(shù)據(jù)庫(kù)，將疾病和相關(guān)因子的流行病學(xué)與可確定因子將在哪些地方發(fā)生的GIS技術(shù)結(jié)合起來(lái)，從而描述在環(huán)境因素影響下的疾病空間分布。美國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生和流行病學(xué)中心負(fù)責(zé)將通過(guò)監(jiān)測(cè)等途徑獲得各種緊急動(dòng)物疫情信息，并通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、流行病學(xué)分析、地理空間分析等多種手段對(duì)某種重大疫病可能對(duì)美國(guó)畜牧業(yè)造成的影響以及可能發(fā)生程度進(jìn)行預(yù)警性風(fēng)險(xiǎn)分析，提出最佳應(yīng)急方案。英國(guó)國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生處下設(shè)的國(guó)際動(dòng)物疫情監(jiān)測(cè)組，24h內(nèi)形成《國(guó)外動(dòng)物疫情定性風(fēng)險(xiǎn)分析》報(bào)告在英國(guó)農(nóng)業(yè)部網(wǎng)站發(fā)布。歐盟的預(yù)警體系包括畜禽及其產(chǎn)品交易監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)、實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)等多個(gè)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。該體系中包括了重大動(dòng)物疫病通報(bào)系統(tǒng)(Animal disease notification system，ADNS)、人畜共患病通報(bào)網(wǎng)絡(luò)等疫情報(bào)告系統(tǒng)。歐、美等國(guó)家對(duì)采取疫苗注射預(yù)防口蹄疫的國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行免疫畜群抗體水平的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，尤其是對(duì)受威脅地區(qū)的抗體監(jiān)測(cè)。從而確定免疫時(shí)間和免疫程序，并通過(guò)對(duì)自然感染動(dòng)物抗體監(jiān)測(cè)來(lái)進(jìn)行發(fā)病危害性評(píng)估 [9]。

2 我國(guó)初步構(gòu)建了生豬疫病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基本框架

在我國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生檢疫工作中，風(fēng)險(xiǎn)分析也逐漸成為預(yù)防控制傳染病的一種重要科學(xué)依據(jù)。通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，確定危害等級(jí)或危害程度，提出進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)管理的具體措施，以達(dá)到控制傳染病傳入的目的。重大動(dòng)物疫病狀況評(píng)估，是基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估理念，著眼于動(dòng)物及動(dòng)物源性產(chǎn)品的飼養(yǎng)、生產(chǎn)、運(yùn)輸消費(fèi)的監(jiān)管、檢疫以及動(dòng)物疫病控制等環(huán)節(jié)，以重大動(dòng)物疫病狀況為因變量，設(shè)定特定區(qū)域和特定時(shí)期內(nèi)的動(dòng)物疫病狀況影響因素為變量，從而對(duì)相應(yīng)時(shí)期和相應(yīng)區(qū)域的重大動(dòng)物疫病狀況水平進(jìn)行的宏觀評(píng)判 [10]。

總結(jié)近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物疫情風(fēng)險(xiǎn)分析的研究文獻(xiàn)，目前我國(guó)動(dòng)物疫病的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估主要是利用蒙特卡洛模型對(duì)疾病分布進(jìn)行擬合，得出相應(yīng)參數(shù)和分布類型。其中比較具有代表性的是李亮等 [11]利用蒙特卡洛法進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的定量研究，以安徽省生豬為例，針對(duì)豬瘟、豬丹毒、豬肺疫等3種主要生豬疫病的風(fēng)險(xiǎn)分布進(jìn)行擬合，利用蒙特卡洛模擬法得出了各自的風(fēng)險(xiǎn)分布類型及參數(shù)，證明Lognormal分布為3種疫病風(fēng)險(xiǎn)的最優(yōu)分布。閆麗君等 [12]通過(guò)將疫病風(fēng)險(xiǎn)與生豬死亡數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行量化，利用蒙特卡洛模型模擬來(lái)解決樣本不足的問(wèn)題。運(yùn)用極值POT模型對(duì)我國(guó)生豬疫病災(zāi)害損失尾部分布進(jìn)行r有效擬合，構(gòu)建了生豬重大疫病損失的廣義Pareto分布模型。利用風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值法，實(shí)證分析和度量了我國(guó)生豬疫病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)水平，計(jì)算出我國(guó)不同等級(jí)的生豬疫病風(fēng)險(xiǎn)損失的95%置信區(qū)間，并提出減輕和控制我國(guó)生豬重大疫病風(fēng)險(xiǎn)的政策建議。現(xiàn)代極值法與蒙特卡洛擬合法相比，避免了在分析極端事件的不足以及可以實(shí)現(xiàn)疫病風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)字化。白金等 [13]根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、專家評(píng)議、風(fēng)險(xiǎn)矩陣分析等方法，確定了規(guī)模豬場(chǎng)豬瘟發(fā)病的各項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素;采用兩兩比較和層次分析法，分別計(jì)算出各項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因子的組合權(quán)重系數(shù)，初步建立了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。在對(duì)于其他動(dòng)物方面，孫向東等 [14]探究影響奶牛布魯菌病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的主要因素及其影響順序。從飼養(yǎng)與調(diào)入、繁育、飼養(yǎng)環(huán)境、混養(yǎng)情況四個(gè)方面，設(shè)定了評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，選取3個(gè)有代表性的地區(qū)進(jìn)行了調(diào)查，應(yīng)用系統(tǒng)多層次灰色關(guān)聯(lián)熵分析方法進(jìn)行奶牛布魯菌病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

3 國(guó)際組織和發(fā)達(dá)國(guó)家建立了完善的動(dòng)物產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系

由于大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家根據(jù)國(guó)際組織的相關(guān)文獻(xiàn)分析、細(xì)化風(fēng)險(xiǎn)分析的各種因素，通過(guò)建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估將動(dòng)物疫病控制得較好 [15]，但來(lái)自畜產(chǎn)品加工等過(guò)程中污染的微生物對(duì)人類健康帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于動(dòng)物疫病本身。國(guó)際組織和很多發(fā)達(dá)國(guó)家建立了對(duì)人類健康影響較大的致病菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系，并發(fā)表了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告。目前聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)與世界貿(mào)易組織(World Trade Organization，WTO)建立了幾種微生物比較完善的微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告，其已經(jīng)出版六個(gè)報(bào)告系列叢書：《沙門菌在雞蛋和肉雞中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估一》，《沙門菌在雞蛋和肉雞中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估二》，《病原體在食物和水中危害特征描述的指導(dǎo)原則》，《即食食品中單核細(xì)胞增生李斯特單胞增生菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的說(shuō)明概要》，《即食食品中單核細(xì)胞增生李斯特單胞增生菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)報(bào)告》，《強(qiáng)化嬰兒食品中阪崎腸桿菌危害評(píng)估會(huì)議報(bào)告》。除此之外，F(xiàn)AO與WHO還進(jìn)行了肉雞中溶血性弧菌及海產(chǎn)品中霍亂弧菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等其他微生物評(píng)估。不僅如此，國(guó)外對(duì)多種致病菌進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究。例如，對(duì)大腸埃希菌O157的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，Perez-Rodriguez F等 [16]建立了大腸埃希菌(O157：H7)在生鮮萵苣葉上的生長(zhǎng)模型，模擬在商業(yè)工業(yè)的加工中的生長(zhǎng)模型得到不同溫度下最大生長(zhǎng)率。Buchanan R L等 [17]研究了pH、NaCl濃度、溫度和氧氣對(duì)大腸埃希菌O157：H7的生長(zhǎng)的影響，并根據(jù)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行Gompertz方程擬合，修改了Gompertz方程的B和M參數(shù)，建立了一個(gè)基于Gompertz方程B和M參數(shù)自然對(duì)數(shù)變換的二次模型，從而建立了大腸埃希菌O157快速增長(zhǎng)估計(jì)模型 [18]。Cassin M H等 [19]將定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(quantitative risk assessment，QRA)、情景分析和預(yù)測(cè)微生物學(xué)結(jié)合起來(lái)對(duì)大腸埃希菌O157：H7進(jìn)行了定量評(píng)估，通過(guò)控制不同的pH、水分活度及氯化鈉濃度來(lái)測(cè)定該菌的生長(zhǎng)情況，對(duì)牛肉漢堡中的大腸埃希菌O157：H7建立了過(guò)程風(fēng)險(xiǎn)模型(process risk model，PRM)。該模型對(duì)病原體在食品生產(chǎn)過(guò)程中的加工、處理、消費(fèi)進(jìn)行了估計(jì)，并作為食品消費(fèi)與健康的暴露評(píng)估。用蒙特卡洛模擬風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型中的不確定性與變化性，通過(guò)對(duì)模型中預(yù)測(cè)因子的修改，可以顯著降低感染大腸埃希菌0157：H7。其他微生物方面，Greinwea M等 [20]將貝葉斯域來(lái)補(bǔ)充蒙特卡洛模型不能處理模型參數(shù)的反饋的缺陷，用來(lái)構(gòu)建完整的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。西班牙學(xué)者是將統(tǒng)計(jì)學(xué)和二階蒙特卡洛模型研究老人人群食用熟肉食感染李斯特菌的情況 [21]。Belda-Galbi C M等 [22]和Coulliette A D等 [23]研究不同的因素來(lái)降低對(duì)大腸埃希菌、李斯特菌和沙門菌等的感染風(fēng)險(xiǎn)。

4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)在我國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品安全中得到初步推廣和應(yīng)用

我國(guó)的動(dòng)物衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)分析起始于20世紀(jì)90年代中期，發(fā)展于21世紀(jì)，先后開(kāi)展了大量動(dòng)物衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)分析理論研究與應(yīng)用，一些省份也建立起了動(dòng)物衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的組織和制度體系。為了加強(qiáng)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在我國(guó)食品安全監(jiān)管中的應(yīng)用，我國(guó)頒布的《食品安全法》中規(guī)定，成立食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專家委員會(huì)開(kāi)展食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作，并將結(jié)果作為制定或修訂食品安全標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)食品安全實(shí)施監(jiān)督管理的科學(xué)依據(jù)。

目前，我國(guó)已啟動(dòng)了食物中毒菌中的沙門菌和大腸埃希菌O157：H7的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，旨在通過(guò)食物中毒暴發(fā)的調(diào)查和運(yùn)用數(shù)學(xué)模型，估計(jì)引起食源性疾病的最低活菌攝入量或造成50%食用者發(fā)病的活菌量。在沙門菌方面，我國(guó)已經(jīng)開(kāi)展了大量工作，趙志晶等 [24]進(jìn)行了中國(guó)帶殼雞蛋中沙門菌定量危險(xiǎn)性評(píng)估的初步研究，該評(píng)估模型模擬了從農(nóng)場(chǎng)到餐桌(即從生產(chǎn)到消費(fèi))由于消費(fèi)帶殼鮮雞蛋引起沙門茵病的危險(xiǎn)性，文中使用了大量的假設(shè)并且數(shù)據(jù)也十分有限，僅是為以后評(píng)估提供了一個(gè)框架，需要新的資料來(lái)不斷完善其模型。王歡等 [25]通過(guò)@Risk軟件推測(cè)合肥市地區(qū)市售雞肉沙門菌的流行率進(jìn)行雞肉中沙門菌的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，但沒(méi)有對(duì)暴露評(píng)估中可能發(fā)生的人體攝入量進(jìn)行評(píng)估。趙瑞蘭等 [26]通過(guò)對(duì)沙門菌在不同條件下生長(zhǎng)情況的研究，建立了不同溫度下?tīng)I(yíng)養(yǎng)肉湯、雞肉中沙門菌的生長(zhǎng)模型，以及不同條件下沙門菌的失活/存活模型，但這些模型僅為一級(jí)生長(zhǎng)模型，缺少實(shí)際應(yīng)用的意義，但為下一步建立二級(jí)生長(zhǎng)模型打下基礎(chǔ)。王軍等 [27]對(duì)我國(guó)豬肉產(chǎn)品致病微生物的污染狀況及影響因素進(jìn)行了調(diào)查，沒(méi)有根據(jù)食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission，CAC)的推薦步驟進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，也沒(méi)有建立豬肉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。董慶利等 [28]對(duì)某市開(kāi)展了即食食品中單增李斯特菌的半定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，構(gòu)建了即食食品中單增李斯特菌的風(fēng)險(xiǎn)矩陣，由風(fēng)險(xiǎn)可能性和風(fēng)險(xiǎn)損失度計(jì)算得到易感人群通過(guò)攝入即食食品感染單增李斯特菌的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)。駱璇等 [29]運(yùn)用大量假設(shè)和@Risk軟件對(duì)上海市豬肉中金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，論文中存在大量不確定性，但為今后開(kāi)展完善豬肉產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。基于OIE風(fēng)險(xiǎn)分析框架和FDA152號(hào)抗菌藥物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南，馬立才 [30]結(jié)合我國(guó)細(xì)菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的現(xiàn)狀建立了肉雞源細(xì)菌耐藥性定性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。在評(píng)估過(guò)程中使用“矩陣法”和“非矩陣法”兩種方法對(duì)風(fēng)險(xiǎn)參數(shù)進(jìn)行整合。

5 啟示

由于我國(guó)國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專家委員會(huì)成立較晚，各項(xiàng)工作仍處于起步階段，食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作與上述發(fā)達(dá)國(guó)家之間還存在很大差距，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估運(yùn)行機(jī)制還不夠完善。主要表現(xiàn)為：檢測(cè)技術(shù)相對(duì)落后，專業(yè)人員不足，獲得評(píng)估數(shù)據(jù)和評(píng)估結(jié)果缺少可信度，管理透明度和評(píng)估工作獨(dú)立性有待于進(jìn)一步加強(qiáng)。此外，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)多為從國(guó)外直接引入，沒(méi)有真正地了解標(biāo)準(zhǔn)制定的詳細(xì)過(guò)程、重要依據(jù)、現(xiàn)實(shí)情況以及國(guó)外的相關(guān)規(guī)定，導(dǎo)致了錯(cuò)誤食品安全信息的存在和流傳。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中模塊化過(guò)程中風(fēng)險(xiǎn)模型僅能評(píng)估當(dāng)前風(fēng)險(xiǎn)而未能考慮流通領(lǐng)域的風(fēng)險(xiǎn)因素和危害溯源等缺陷，都需要我們進(jìn)一步的改進(jìn)。評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)食品產(chǎn)品安全的影響程度，管理者通過(guò)綜合考慮控制效果和成本能夠選擇合適的風(fēng)險(xiǎn)控制措施，為企業(yè)在生產(chǎn)流通過(guò)程中預(yù)防和管理安全風(fēng)險(xiǎn)提供有力的工具，體現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值 [31]。

我們要認(rèn)識(shí)到動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的作用十分重要：可以為動(dòng)物的疫病的檢測(cè)和預(yù)防提供基礎(chǔ)信息;可以為動(dòng)物產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。為確定進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和管理的優(yōu)先內(nèi)容提供科學(xué)依據(jù);一個(gè)政府制定的相關(guān)的食品安全管理措施，哪怕是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，或者是一個(gè)規(guī)章制度，到底在實(shí)施以后有沒(méi)有效果，都要在實(shí)施前后進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的技術(shù)在不斷發(fā)展，我國(guó)也要不斷借鑒國(guó)外的先進(jìn)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步的探索和完善我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，應(yīng)建立動(dòng)物衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估管理機(jī)制，使風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以發(fā)揮更大的作用。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第2篇

題目：熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物心肌細(xì)胞影響研究進(jìn)展

摘要：熱應(yīng)激是動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常遇到的難題，給畜牧業(yè)帶來(lái)了較大的損失。由于心臟對(duì)熱的敏感性較高，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體遭受熱應(yīng)激損害時(shí)，首當(dāng)其沖的器官往往是心臟。所以，如何提高心臟抵抗熱應(yīng)激的損傷，成為養(yǎng)殖業(yè)日益關(guān)注的焦點(diǎn)。論文從熱應(yīng)激對(duì)心臟的影響、心肌細(xì)胞在熱應(yīng)激作用下的組織形態(tài)學(xué)變化、熱應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的機(jī)制、熱應(yīng)激作用下心肌細(xì)胞的自我保護(hù)及如何提高心肌細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激的抵抗能力方面，結(jié)合近年來(lái)的研究做一綜述。

關(guān)鍵詞：熱應(yīng)激;心肌細(xì)胞;損傷

熱應(yīng)激(heat stress)是動(dòng)物集約化飼養(yǎng)中經(jīng)常遇到一大難題，給動(dòng)物的生長(zhǎng)、繁殖帶來(lái)較大的損失[1]。例如籠養(yǎng)肉雞常常因?yàn)槭艿郊毙詿釕?yīng)激而猝死，即使在慢性熱應(yīng)激下也會(huì)因?yàn)槭澄锵穆实汀⒋x受阻而生長(zhǎng)緩慢。

心臟是熱應(yīng)激較為敏感的器官。從宏觀角度分析，當(dāng)動(dòng)物處于熱應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，高溫刺激體溫調(diào)節(jié)中樞-下丘腦，并在下丘腦的調(diào)節(jié)下，機(jī)體加快散熱，呼吸加快，體表血液流動(dòng)加快，其心率也會(huì)加快，從而加重了心臟的負(fù)擔(dān)，容易造成心肌損傷;從微觀角度觀察，有試驗(yàn)表明，心肌細(xì)胞在持續(xù)熱應(yīng)激作用下會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的腫脹、變性[2]。當(dāng)心肌受到損傷時(shí)，動(dòng)物的健康也就受到了嚴(yán)重的威脅。所以，保護(hù)心肌細(xì)胞免受熱應(yīng)激的損傷成為當(dāng)下研究熱應(yīng)激的熱點(diǎn)之一。在國(guó)內(nèi)外的研究中，持續(xù)的熱應(yīng)激往往造成心肌細(xì)胞的凋亡，然而熱應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制還不是很清晰。本文就近年來(lái)有關(guān)熱應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞影響的研究進(jìn)行綜述，為探討熱應(yīng)激對(duì)心肌的影響機(jī)制提供參考。

1 熱應(yīng)激對(duì)心臟的影響

心臟是動(dòng)物機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)中最重要的器官，當(dāng)動(dòng)物處于熱應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，首當(dāng)其沖的器官往往就是心臟。眾所周知，當(dāng)高溫刺激下丘腦溫度調(diào)節(jié)中樞時(shí)，機(jī)體表現(xiàn)出呼吸加快，心率加快，體表血液流速加快。持續(xù)的熱應(yīng)激會(huì)給心臟帶來(lái)較大的負(fù)擔(dān)，最終導(dǎo)致心臟衰竭。

有研究學(xué)者將肉雞置于不同高溫下，并在不同的時(shí)間段檢測(cè)肉雞股動(dòng)脈壓和右心室內(nèi)壓，發(fā)現(xiàn)股動(dòng)脈壓顯著下降，且溫度越高，股動(dòng)脈壓下降的速度越快;而通過(guò)記錄不同時(shí)間段的右心室內(nèi)壓，可以計(jì)算出右心室內(nèi)壓的最大變化速率，右心室內(nèi)壓的最大變化速率可反映出右心室收縮和舒張的功能狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)表明右心室內(nèi)壓的最大變化速率顯著下降，說(shuō)明右心室在熱應(yīng)激作用下?lián)p傷嚴(yán)重[3]。

與上述試驗(yàn)相類似，高俊濤等[4]對(duì)SD大鼠做左心室插管手術(shù)，并檢測(cè)可以反映心肌收縮力的等容收縮期左心室壓力的最大值(left ventricular systolic pressure，LVSP)以及反映心臟功能狀態(tài)的左心室等容收縮期壓力變化最大速率(+dp/dt)等相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激初期LVSP，+dp/dt均逐漸升高，而1 h后兩者均顯著下降，反映出長(zhǎng)時(shí)間的熱應(yīng)激造成左心室收縮力下降以及使心臟出現(xiàn)功能障礙的現(xiàn)象。提示，持續(xù)熱應(yīng)激會(huì)給動(dòng)物心臟造成嚴(yán)重的損傷。

2 熱應(yīng)激作用下心肌組織形態(tài)學(xué)變化

處在熱應(yīng)激狀態(tài)下的動(dòng)物，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)熱休克和猝死現(xiàn)象。雖然這種熱休克和猝死是由多種原因引起，但心肌細(xì)胞往往最先遭受到嚴(yán)重的熱應(yīng)激損傷。Wu Di等[5]將肉雞置于熱應(yīng)激狀態(tài)下并對(duì)其心肌細(xì)胞做組織切片觀察，熱應(yīng)激1 h之后，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹狀態(tài);熱應(yīng)激5 h之后，出現(xiàn)心肌組織萎縮、心肌細(xì)胞核固縮;熱應(yīng)激15 h之后心肌細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性、心肌纖維之間的間隙變大等特征。心肌組織的這種變化不僅僅出現(xiàn)在肉雞中，Islam A等[6]通過(guò)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞放置在42℃環(huán)境下，觀察心肌細(xì)胞在不同時(shí)間段內(nèi)的變化，最終發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)與上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象相似的組織形態(tài)學(xué)變化。提示熱應(yīng)激會(huì)給動(dòng)物心肌組織造成嚴(yán)重的損傷。

3 熱應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的機(jī)制

根據(jù)上述心肌組織學(xué)變化可知，當(dāng)動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間處于熱應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，熱應(yīng)激損傷的最終結(jié)果是導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。此外，心肌組織處在熱應(yīng)激下會(huì)在血清中釋放一些重要的酶，如肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)等[7]，同時(shí)產(chǎn)生大量的自由基。通過(guò)檢測(cè)血清中生化指標(biāo)的變化，可以從側(cè)面反映出心肌細(xì)胞在熱應(yīng)激作用下受到的傷害。

3.1 熱應(yīng)激作用下心肌組織內(nèi)的生化指標(biāo)的變化

CK和CK-MB在心肌組織中的含量豐富，兩者聯(lián)合LDH是檢測(cè)心肌損傷的重要生化指標(biāo)[8]。李昌武等[9]在試驗(yàn)中證實(shí)，當(dāng)小鼠處在熱應(yīng)激狀態(tài)下，其血清中的CK、CK-MB和LDH活力均呈上升趨勢(shì)，提示心肌在熱應(yīng)激下而受損。這與仲慶振等[10]在研究急性熱應(yīng)激對(duì)鵝心臟損傷中所測(cè)得的CK活力上相一致，同樣與井然等[11]所測(cè)得的高溫環(huán)境中大鼠血清中LDH和CK-MB活力顯著升高相一致。如此以來(lái)，便可以通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物血清中相關(guān)酶的變化，方便而快捷的診斷出動(dòng)物心肌細(xì)胞受到熱應(yīng)激損傷的程度，同時(shí)尋找降低這些酶活性的方法，便可以減輕熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物心肌的傷害。

3.2 熱應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制

目前國(guó)內(nèi)外研究中，關(guān)于熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制還不甚清晰。Slimen I B等[12]指出熱應(yīng)激可以引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激可通過(guò)多條途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示熱應(yīng)激是通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。最近有學(xué)者提出，較長(zhǎng)時(shí)間的熱應(yīng)激可觸發(fā)心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)凋亡途徑[13]。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)凋亡途徑會(huì)與線粒體凋亡途徑相匯合，其凋亡的最后一步依然由線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-3而最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。

王曉武等[15]將小鼠置于潮濕高溫環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)其心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，同時(shí)檢測(cè)到血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)大量生成，而AngⅡ可通過(guò)P38 MAPK信號(hào)通路使caspase-3活化，以及聯(lián)合濕熱環(huán)境誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生高濃度的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。由此可知，熱應(yīng)激既可以通過(guò)內(nèi)源性通路，也可以通過(guò)外源性通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

有研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可以引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載以及機(jī)體的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體膜通透性的改變，并釋放出細(xì)胞色素C，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡[17-18]。提示線粒體在心肌細(xì)胞中的重要作用，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激引起的凋亡的，其關(guān)鍵就在于保護(hù)心肌線粒體。

4 熱應(yīng)激作用下心肌細(xì)胞的自我保護(hù)

眾所周知，當(dāng)細(xì)胞受到熱應(yīng)激或其他應(yīng)激時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)會(huì)迅速大量合成一類具有分子伴侶功能的蛋白質(zhì)——熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)。同樣，心肌細(xì)胞也能合成Hsp。其中Hsp70是得到廣泛研究的一種熱休克蛋白。Hsp70已經(jīng)被證實(shí)可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡，但其抑制凋亡的機(jī)制尚不清楚。

近年來(lái)Hsp70的抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)，例如Hsp70可以抑制Fas介導(dǎo)的應(yīng)激性心肌細(xì)胞凋亡[19]。然而，Hsp70在心肌細(xì)胞中的含量隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，而當(dāng)Hsp70降到最低水平時(shí)，心肌細(xì)胞也出現(xiàn)了嚴(yán)重?fù)p傷。提示Hsp70可能通過(guò)某種機(jī)制抵抗熱應(yīng)激對(duì)心肌的損傷[20]。心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp70水平隨時(shí)間的變化與仲慶振等人的研究相一致[10]。提示，Hsp無(wú)法長(zhǎng)期穩(wěn)定的高表達(dá)也可能是持續(xù)熱應(yīng)激導(dǎo)致心肌凋亡的重要原因。

5 如何提高心肌細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激的抵抗能力

由于熱應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷與動(dòng)物機(jī)體其他組織細(xì)胞的損傷有一定的相關(guān)性，如熱應(yīng)激會(huì)增加機(jī)體ROS的含量，高濃度的ROS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[16]。熱應(yīng)激作為非特異性應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的其他器官同樣會(huì)造成嚴(yán)重的傷害。所以，提高心肌細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激的抵抗通常從動(dòng)物整體水平上降低熱應(yīng)激的損傷。例如，通過(guò)降低環(huán)境溫度來(lái)加快動(dòng)物機(jī)體的散熱;飼喂具有抗氧化作用的中藥復(fù)方可顯著降低動(dòng)物血清中的ROS等。

我國(guó)學(xué)者曾通過(guò)對(duì)中草藥的研究，尋求抗熱應(yīng)激的方法，并且取得了一定的效果。例如近年來(lái)發(fā)現(xiàn)水母雪蓮可以顯著降低熱應(yīng)激作用下的小鼠血清中心肌損傷標(biāo)準(zhǔn)物CK、LDH等的含量，從而減輕了熱應(yīng)激對(duì)小鼠心肌細(xì)胞的傷害[21]。

抗氧化劑可以清除機(jī)體內(nèi)的ROS，從而達(dá)到抗熱應(yīng)激的目的，如維生素E、硒等。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)維生素E可以通過(guò)增加心肌細(xì)胞內(nèi)的金屬硫蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抵抗熱應(yīng)激而保護(hù)心肌細(xì)胞目的[22]。近年來(lái)，在心肌組織中發(fā)現(xiàn)牛磺酸的含量非常豐富。牛磺酸具有清除ROS，降低血清中CK、LDH等心肌損傷標(biāo)志物，抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用[23]，并且可直接作為飼料添加物而受到廣泛關(guān)注。2000年發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)可以水解Ang Ⅱ[24]，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受Ang Ⅱ引起的細(xì)胞凋亡。

6 小結(jié)

綜合近年來(lái)熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物心肌細(xì)胞的影響研究可知，心臟很容易遭受到熱應(yīng)激的損傷。雖然心肌細(xì)胞可以通過(guò)合成Hsp進(jìn)行短暫的抵抗，但長(zhǎng)時(shí)間的熱應(yīng)激仍然可以給心肌細(xì)胞帶來(lái)嚴(yán)重的傷害，甚至造成心肌細(xì)胞的凋亡。在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中，提高動(dòng)物抵抗熱應(yīng)激的重要一環(huán)就是提高動(dòng)物心肌對(duì)熱應(yīng)激的抵抗。但無(wú)論是在飼養(yǎng)條件方面，還是在營(yíng)養(yǎng)水平上，都應(yīng)盡量避免熱應(yīng)激的發(fā)生。從機(jī)體整體水平上減輕熱應(yīng)激損傷的同時(shí)，還應(yīng)積極探討熱應(yīng)激對(duì)心臟損傷的具體機(jī)制，尋找改善和提高心肌細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激能力的方法。

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動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第3篇

題目：探討生態(tài)環(huán)境與動(dòng)物醫(yī)學(xué)

摘要：生態(tài)環(huán)境對(duì)動(dòng)物生命活動(dòng)及其致病因素的影響十分巨大而深遠(yuǎn);動(dòng)物的生命活動(dòng)及其致病因素對(duì)生態(tài)環(huán)境影響直接而明顯;兩者相互關(guān)聯(lián)、相互影響、相互作用、互為一個(gè)整體。因此動(dòng)物醫(yī)學(xué)應(yīng)將生態(tài)環(huán)境從宏觀上作為重要的研究對(duì)象，并在實(shí)踐中采取綜合措施才能既有效地控制疫病、又能保證生態(tài)環(huán)境。研究和應(yīng)用生態(tài)環(huán)境與動(dòng)物醫(yī)學(xué)之間的關(guān)系，具有很重要的作用和意義。

關(guān)鍵詞：生態(tài)環(huán)境 動(dòng)物醫(yī)學(xué) 應(yīng)用

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在醫(yī)學(xué)研究中有著重要的意義，是醫(yī)學(xué)研究中的重要方法。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程的運(yùn)行管理，對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的 效果及科研成果尤其重要。我們做了100只家兔耳緣靜脈的留置針輸液實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程順利，取得滿意效果。現(xiàn)將其經(jīng)驗(yàn)及做法總結(jié)如下。

一、動(dòng)物的選擇

1.動(dòng)物來(lái)源確定 動(dòng)物來(lái)源要選擇國(guó)家、省相關(guān)部門確定的醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，其中包括《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》、《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》的規(guī)定并取得醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件的合格證明書。 其要求實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的同種屬、同品系、同月齡、性別雌雄比例。

2 .熟悉并了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 在實(shí)驗(yàn)前，準(zhǔn)備階段要到相應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室對(duì)參加實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物進(jìn)行初步的觀察、了解，主要觀察其生活習(xí)性、了解飼養(yǎng)要求等，重點(diǎn)掌握實(shí)驗(yàn)的組織、器官等生理解剖部位、特點(diǎn)、并作初步評(píng)估。

二、預(yù)實(shí)驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)是對(duì)研究技術(shù)、方法的訓(xùn)練，對(duì)設(shè)計(jì)方案的實(shí)踐評(píng)估，同時(shí)可以了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)各種處理因素的反應(yīng)情況，以及在試驗(yàn)過(guò)程中，動(dòng)物在生理、精神狀態(tài)、飼養(yǎng)等方面可能出現(xiàn)的一些問(wèn)題作以了解，以便在正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中作好提前的預(yù)防、分析，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程的順利實(shí)施。

三、實(shí)驗(yàn)效果

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要消耗一定的人力、物力、財(cái)力，所以對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須周密布置，諸如以上各項(xiàng)做法，盡最大限度地保 障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量。以達(dá)到預(yù)期的目的。

四、討論與分析

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)盡管有一定的不足，但在人體實(shí)驗(yàn)之前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是很重要的醫(yī)學(xué)研究方法，因此，從事醫(yī)療科研人員應(yīng)該更多熟悉、了解和掌握有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基本知識(shí)和技巧，為臨床科研工作做好基礎(chǔ)。例如：

1.生態(tài)環(huán)境對(duì)動(dòng)物生命活動(dòng)及致病因素的影響作用

生態(tài)環(huán)境對(duì)動(dòng)物種群結(jié)構(gòu)的影響。不同地區(qū)、不同的生態(tài)環(huán)境，由于物種進(jìn)化的直接原因?qū)е铝藙?dòng)物種群結(jié)構(gòu)的不同。最直接的例子是農(nóng)區(qū)與牧區(qū)從家畜家禽的品種、數(shù)量及生產(chǎn)性能上就明顯不同。僅以牛為例，西部主要是牦牛及揙牛、中東部主要是黃牛而南方多為水牛。生態(tài)環(huán)境對(duì)動(dòng)物種群結(jié)構(gòu)的影響主要是受自然因素的制約。如不同的氣溫、海拔、日照、濕度、植物結(jié)構(gòu)、降水、河流分布等等直接選擇并影響了動(dòng)物的品種。人們的生產(chǎn)生活對(duì)動(dòng)物及其生命活動(dòng)的選擇也深刻地影響了動(dòng)物種群結(jié)構(gòu)。不同族群、不同的生活習(xí)俗、不同的信仰、不同的生產(chǎn)生活方式深刻地選擇了動(dòng)物的進(jìn)化方向和動(dòng)物的種群結(jié)構(gòu)。如牦牛和麋鹿的飼養(yǎng)就體現(xiàn)了這種選擇的影響。

生態(tài)環(huán)境對(duì)動(dòng)物生命活動(dòng)的影響。生態(tài)環(huán)境特別是自然環(huán)境影響著動(dòng)物生命活動(dòng)的每一個(gè)環(huán)節(jié)。我國(guó)西北牧區(qū)畜群的一個(gè)典型現(xiàn)象——“夏飽、秋肥、冬瘦、春死亡”就是這一影響的結(jié)果;我國(guó)的黃牛從東南到西北，從低海拔到高海拔，從平原到山區(qū)其產(chǎn)肉性能、泌乳性能及皮毛肉乳產(chǎn)品的質(zhì)量差異也主要是這一影響的結(jié)果。人們的生產(chǎn)生活及需要直接干預(yù)了動(dòng)物的整個(gè)生命活動(dòng)。人們?yōu)榱俗陨淼男枰苯痈深A(yù)動(dòng)物的生命活動(dòng)過(guò)程，其影響持續(xù)而且巨大。漢唐初期國(guó)家為了戰(zhàn)爭(zhēng)需要，全國(guó)大規(guī)模飼養(yǎng)戰(zhàn)馬;改革開(kāi)放以來(lái)，大量引進(jìn)國(guó)外奶牛、生豬及家禽，使我國(guó)本地畜禽品種數(shù)量銳減甚至個(gè)別消失;為了提高產(chǎn)量，人們大量采用人工授精技術(shù)、采用規(guī)模化養(yǎng)殖方式等等技術(shù)，使動(dòng)物的每一個(gè)生命活動(dòng)都受到人為的干預(yù)，其影響和結(jié)果差異十分明顯。

2.動(dòng)物生命活動(dòng)及病源微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境及人們生產(chǎn)生活的影響

動(dòng)物生命活動(dòng)對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響。生物鏈對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響十分明顯，進(jìn)化論及生態(tài)學(xué)都證明了生物鏈中任何一環(huán)的失衡對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響都十分巨大。例如物種之間的競(jìng)爭(zhēng)、物種內(nèi)部的競(jìng)爭(zhēng)都直接影響著生態(tài)環(huán)境。動(dòng)物的個(gè)體生命活動(dòng)、群體生命活動(dòng)對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響和作用相當(dāng)深刻。例如動(dòng)物的季節(jié)性遷徒、動(dòng)物的排污，特別是動(dòng)物的疾病、死亡及尸體對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響與作用是直接而明顯的。

病源微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境及人們生產(chǎn)活動(dòng)的影響。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直把致病因素作為負(fù)面的對(duì)象進(jìn)行研究，其實(shí)致病因素特別是病源微生物本身就是生態(tài)環(huán)境中最基本的一環(huán)，是微生態(tài)環(huán)境中最重要的一環(huán)。動(dòng)物疾病的發(fā)生從本質(zhì)上講是致病因素在生態(tài)環(huán)境中從微觀到宏觀的水平上失衡導(dǎo)致的。因此動(dòng)物致病因素深刻而且巨大地影響著生態(tài)環(huán)境中動(dòng)物的生命活動(dòng)，使其個(gè)體、群體在微觀和宏觀水平上失衡。利用病源微生物在生態(tài)環(huán)境中的作用可以深刻地影響人類活動(dòng)。人們利用牛痘預(yù)防天花，現(xiàn)在人類已消滅了天花;青霉素的生產(chǎn)和使用挽救了無(wú)數(shù)人的生命，但現(xiàn)在的濫用又給人類和環(huán)境造成了巨大的危害。

總之，由此可以看出生態(tài)環(huán)境與動(dòng)物的生命活動(dòng)及致病因素之間是相互聯(lián)系、相互作用、相互影響的一個(gè)有機(jī)的統(tǒng)一整體。傳統(tǒng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)的目的是控制并治療好疾病，而研究和利用動(dòng)物環(huán)境醫(yī)學(xué)的目的是怎樣不讓動(dòng)物及其群體生病或盡可能少地生病，因此研究和利用動(dòng)物環(huán)境醫(yī)學(xué)具有深遠(yuǎn)的作用和意義。所以動(dòng)物醫(yī)學(xué)在研究對(duì)象上應(yīng)該從宏觀角度把生態(tài)環(huán)境作為一個(gè)整體來(lái)進(jìn)行，才能準(zhǔn)確地把握疾病的發(fā)生、發(fā)展及流行方式，才能綜合采取措施，做到既能防控病癥，又能保證生態(tài)環(huán)境，只有這樣才能使畜牧業(yè)健康持續(xù)科學(xué)地發(fā)展，而不是一味地追求畜牧經(jīng)濟(jì)存量及利益的最大化。因此研究和應(yīng)用生態(tài)環(huán)境與動(dòng)物醫(yī)學(xué)之間的關(guān)系以指導(dǎo)畜牧業(yè)生產(chǎn)、約束人們的生產(chǎn)生活方式、達(dá)到最佳的疾病防控目的，具有極其重要的意義和作用。

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動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第4篇

題目：牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的以高熱、腹瀉、懷孕母牛流產(chǎn)或胎兒畸形、口腔和消化道黏膜糜爛、壞死及血小板和白細(xì)胞減少為主要特征的接觸性傳染病[1]。BVDV的自然宿主是牛，感染懷孕牛后，可導(dǎo)致持續(xù)性感染(persistent infection，PI)牛犢的出生，PI牛在整個(gè)生存周期持續(xù)排出大量感染性病毒顆粒，是易感動(dòng)物感染病毒的主要來(lái)源。目前BVD呈全球性分布，給各國(guó)的養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，急性感染的病牛導(dǎo)致的損失達(dá)每頭牛46.5美元[2]。

BVDV包括BVDV-1、BVDV-2兩種基因型，每種基因型都包括致細(xì)胞病變型(cytopathic，CP)和非致細(xì)胞病變型(non-cytopathic,NCP)兩種生物型。根據(jù)5’-UTR、Npro和E2基因序列的差異，將BVDV-1分為至少22個(gè)基因亞型，將BVDV-2分為4個(gè)基因亞型。BVDV在我國(guó)各個(gè)省份均有流行，且流行形勢(shì)較為復(fù)雜，新疆、云南等地部分牛場(chǎng)的BVDV陽(yáng)性率達(dá)60%以上[3-4]。有些地區(qū)牛群中甚至同時(shí)流行多種亞型[5]。當(dāng)前，BVDV的防控主要依靠疫苗免疫及清除PI牛，而如何準(zhǔn)確對(duì)BVDV感染牛及PI牛進(jìn)行鑒別診斷顯得尤為重要。本文綜述了國(guó)內(nèi)外BVDV檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，以期為BVD的防控和凈化提供參考。

1 病原學(xué)診斷

1.1 病毒的分離鑒定

各種牛源細(xì)胞均可用于BVDV的分離培養(yǎng)，目前最常用的是傳代牛腎(MDBK)細(xì)胞。將病毒分離材料，如牛血清樣本、分泌物、排泄物等經(jīng)過(guò)處理后接種MDBK細(xì)胞，如是致細(xì)胞病變型毒株，可在接種細(xì)胞后的最初幾代內(nèi)出現(xiàn)皺縮、變圓、拉網(wǎng)、脫落，聚集后產(chǎn)生合胞體和巨細(xì)胞等現(xiàn)象即可初步確定為BVDV。而非致細(xì)胞病變型毒株，則需盲傳3代～5代，最終結(jié)合免疫熒光等方法確定病毒分離成功。BVDV的分離鑒定是最基礎(chǔ)的檢測(cè)BVDV的技術(shù)，是鑒別BVDV感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該項(xiàng)技術(shù)不需要特殊的儀器設(shè)備，僅進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)即可。但該方法操作周期較長(zhǎng)，不能滿足BVDV快速檢測(cè)的需求，且不適用于大量樣本的檢測(cè)。此外，該項(xiàng)技術(shù)對(duì)細(xì)胞、血清的要求較高，特別是近些年作為細(xì)胞分離培養(yǎng)原材料之一的胎牛血清中BVDV污染較為嚴(yán)重，較大程度限制了該方法的使用。目前有研究人員使用異源血清進(jìn)行分離培養(yǎng)[6]。

1.2 電鏡檢查

電鏡檢查是觀察BVDV顆粒的經(jīng)典方法，常用的有直接電鏡技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。直接電鏡技術(shù)對(duì)BVDV樣本的量要求較高(約107個(gè)/mL)，觀察到的BVDV顆粒通常是散在的，但可觀察到病毒粒子的自然形態(tài)。李禎等[6]在透射電鏡下觀察到直徑為40 nm～60nm的球形、外被囊膜的BVDV顆粒。而免疫電鏡技術(shù)通常可見(jiàn)到大量的BVDV顆粒聚集在一起。王冶才等[7]利用免疫電鏡技術(shù)，觀察到大小不等的BVDV粒子。相較于直接電鏡技術(shù)，免疫電鏡技術(shù)敏感性更好，且可更快速地觀察到病毒粒子。近些年又發(fā)展出檢測(cè)BVDV的蛋白A膠體金免疫電鏡技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的直接電鏡技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)，該技術(shù)敏感性更高，更快速。但不管是哪種電鏡技術(shù)，均需專業(yè)人員使用專業(yè)的儀器設(shè)備進(jìn)行操作，檢測(cè)成本較高，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，僅適用于初篩為BVDV陽(yáng)性樣本的確認(rèn)，該方法只能用于BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，無(wú)法推廣到基層。

2 血清學(xué)方法

2.1 血清中和試驗(yàn)

血清中和試驗(yàn)是對(duì)BVDV或抗體進(jìn)行定性或定量分析的一種方法，在實(shí)際操作中，可對(duì)疑似感染牛間隔3周～4周前后采血2次，測(cè)定血清的中和抗體效價(jià)，如果第2次高于第1次4個(gè)滴度以上可判為陽(yáng)性，2個(gè)滴度以上，視為疑似患病。該方法敏感性高、特異性好、可重復(fù)性強(qiáng)，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)推薦的檢測(cè)BVDV抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，廣泛用于BVDV的血清學(xué)調(diào)查。但在檢測(cè)抗體時(shí)，因BVDV不同基因型及基因亞型的抗原性存在差異，抗原的選擇會(huì)對(duì)抗體滴度的精確定量存在影響[8]，且由于持續(xù)性感染牛對(duì)病毒缺乏免疫應(yīng)答而不產(chǎn)生抗體，在進(jìn)行血清中和試驗(yàn)時(shí)會(huì)因?yàn)殛幮越Y(jié)果而造成誤判。此外，該方法操作較為繁瑣，周期長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，目前僅用于BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

目前檢測(cè)BVDV的常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)包括間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、阻斷ELISA、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)、葡萄球菌A蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(PPA-ELISA)、單層酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(M-ELISA)及細(xì)胞內(nèi)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(In Cell-ELISA)等。

2.2.1 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是檢測(cè)BVDV抗體的常用方法，可用于檢測(cè)樣品中BVDV總抗體的濃度。但采用全病毒作為包被抗原需對(duì)BVDV大量增殖后進(jìn)行濃縮和純化，難度較高。為彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，可采用重組蛋白作為包被抗原，其中結(jié)構(gòu)蛋白Erns和E2及非結(jié)構(gòu)蛋白p80因免疫原性較強(qiáng)，常作為包被抗原。陳瑞紅[9]將3種蛋白分別進(jìn)行原核表達(dá)并建立ELISA方法，通過(guò)比較，認(rèn)為重組蛋白E2作為包被抗原建立的間接ELISA方法更為特異。

2.2.2 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 捕獲抗體和檢測(cè)抗體一般由不同種屬的動(dòng)物制備，如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇2個(gè)針對(duì)BVDV不同抗原決定簇的單克隆抗體。胡俊英等[10]制備了抗BVDV E2蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，并以此建立了基于單克隆抗體捕獲BVDV抗原的雙抗體夾心ELISA方法，動(dòng)物感染病毒后可通過(guò)檢測(cè)其糞便排泄物的BVDV抗原作出早期診斷。丁金華[11]與周子恒[12]分別利用納米抗體和多克隆抗體建立基于抗BVDV納米抗體雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，用于檢測(cè)BVDV，雖然方法在敏感性方面存在問(wèn)題，檢測(cè)效果不理想，但將納米抗體引入ELISA方法的建立過(guò)程，仍為BVDV檢測(cè)方法的改進(jìn)提供了新思路。

2.2.3 阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)也稱競(jìng)爭(zhēng)ELISA，當(dāng)待檢樣品無(wú)法提純或不能進(jìn)行稀釋時(shí)，可用此法檢測(cè)BVDV特異性抗體。王新平等[13]建立了雙抗體夾心阻斷ELISA方法，并對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)293頭奶牛和262頭黃牛的血清樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示,黃牛抗體陽(yáng)性率高達(dá)43.5%。但阻斷ELISA的缺點(diǎn)是操作較為繁瑣，用時(shí)較長(zhǎng)。

2.2.4 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種經(jīng)濟(jì)、快捷，可肉眼直接判定的ELISA方法，適合BVDV的臨床診斷及抗體監(jiān)測(cè)。Zhao Y L等[14]建立了檢測(cè)BVDV抗體的間接Dot-ELISA，與Idexx ELISA試劑盒相比，該方法的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性分別為96.7%、92.5%和95%。

2.2.5 葡萄球菌A蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 葡萄球菌A蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是利用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白代替酶標(biāo)二抗建立的ELISA方法，其優(yōu)點(diǎn)是可用于多種哺乳動(dòng)物抗體的檢測(cè)。柴順秀等[15]利用BVDV重組E2蛋白建立了檢測(cè)BVDV血清抗體的E2-PPA-ELISA方法，結(jié)果顯示與Idexx ELISA試劑盒的檢出率無(wú)顯著差異。

2.2.6 單層酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及In Cell酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 單層酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是將細(xì)胞培養(yǎng)與ELISA結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)。研究人員通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)BVDV時(shí)，M-ELISA與病毒分離試驗(yàn)敏感性無(wú)顯著性差異，但比免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)方法更快速，且更客觀。In Cell-ELISA是一種用于檢測(cè)和分析BVDV感染的新方法，將BVDV的傳染性標(biāo)準(zhǔn)化為培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量，可用于CP和NCP毒株的檢測(cè)[16]。ELISA方法是目前檢測(cè)BVDV應(yīng)用最廣泛的方法之一，與經(jīng)典的病毒分離等方法相比，該方法可同時(shí)對(duì)批量樣本進(jìn)行檢測(cè)，且對(duì)儀器設(shè)備和試驗(yàn)人員的要求較低。但利用ELISA方法進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè)時(shí)，容易受到母源抗體的干擾，且與同屬的豬瘟病毒(Classical swine fever viru，CSFV)之間存在交叉反應(yīng)，也不能對(duì)PI牛進(jìn)行篩選。

2.3 免疫熒光技術(shù)

檢測(cè)BVDV常用的方法有直接免疫熒光技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)。直接免疫熒光技術(shù)即將熒光素標(biāo)記在抗體上，直接與BVDV抗原發(fā)生反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快捷，特異性高，非特異性染色少，缺點(diǎn)是敏感性低，且標(biāo)記的抗體需達(dá)到一定濃度，否則熒光太弱，影響結(jié)果的觀察。此外，有研究表明BVDV基因型及抗原差異對(duì)直接免疫熒光試驗(yàn)影響較大[17]。間接免疫熒光方法較直接免疫熒光方法敏感性提高，該方法與血清中和試驗(yàn)、病毒分離試驗(yàn)的結(jié)果高度相關(guān)，且敏感性高于抗原捕獲ELISA，更適合用于血清中BVDV抗原的檢測(cè)[18-20]，但其缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生非特異性熒光。不管是直接方法還是間接方法，都需要使用熒光顯微鏡，對(duì)儀器設(shè)備的要求較高，一般僅用于BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，無(wú)法用于基層檢驗(yàn)。

2.4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)靈敏度不高，與微量中和試驗(yàn)的陽(yáng)性率之間差異極顯著(P<0.01)[21]，且僅能檢測(cè)出BVDV群特異性抗體，與CSFV存在交叉反應(yīng)。不能用于BVD的精確診斷，盡管如此，因瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊的設(shè)備或試劑，可用于大量血清樣本的檢測(cè)，常作為基層BVDV檢測(cè)的初篩方法。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 核酸擴(kuò)增

3.1.1 RT-PCR 目前已廣泛用于BVDV的鑒定、分型及遺傳進(jìn)化分析，對(duì)CP型和NCP型毒株均可檢測(cè)，該方法特異性高、敏感性強(qiáng)、檢測(cè)周期短，能批量檢測(cè)臨床樣本，且多次檢測(cè)時(shí)可篩選出群體中的持續(xù)性感染動(dòng)物[22]，對(duì)于BVDV的防控具有重要意義。隨后，在普通PCR的基礎(chǔ)上，研究人員又建立了套式RT-PCR及可同時(shí)檢測(cè)BVDV與常見(jiàn)牛腹瀉疾病的雙重或多重RT-PCR方法，檢測(cè)靈敏度高于普通PCR[23]，且大大提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。但普通RT-PCR只能定性分析，需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果，在操作過(guò)程中常因氣溶膠污染出現(xiàn)假陽(yáng)性，且存在非特異性條帶時(shí)容易產(chǎn)生誤判。因此，在操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，保障結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然該方法應(yīng)用廣泛，但因需要PCR儀，尚無(wú)法推廣到基層進(jìn)行使用。

3.1.2 熒光定量RT-PCR 在普通RT-PCR基礎(chǔ)上，研究人員建立了檢測(cè)BVDV的熒光定量RT-PCR方法，敏感性顯著高于RT-PCR[24]，且能定量分析待檢樣品。加入反應(yīng)體系后不必打開(kāi)反應(yīng)管，一定程度上避免了氣溶膠污染。但該方法需要熒光定量PCR儀，儀器的使用和維護(hù)成本較高，試劑和耗材也高于普通PCR儀，僅可用于BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

3.1.3 RT-LAMP 近年來(lái)，隨著環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的發(fā)展，研究人員建立了可用于BVDV檢測(cè)的RT-LAMP檢測(cè)方法，該方法雖然與病毒分離方法的陽(yáng)性率差異較大，但與Idexx抗原捕獲ELISA方法的陽(yáng)性率無(wú)明顯差異[25]，且從試驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜程度、擴(kuò)增反應(yīng)效率、使用儀器簡(jiǎn)單程度及檢測(cè)成本等方面均優(yōu)于熒光定量RT-PCR和普通RT-PCR[26]，更適合用于基層BVDV的快速檢測(cè)。范晴等[27]在RT-LAMP的基礎(chǔ)上，在LAMP引物中標(biāo)記熒光基團(tuán)，建立了二重?zé)晒釸T-LAMP，反應(yīng)后通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色讀取反應(yīng)結(jié)果，可準(zhǔn)確鑒別檢測(cè)BVDV和牛輪狀病毒(Bovine rotavirus,BRV)兩種病毒，解決了國(guó)內(nèi)多重LAMP方法不能準(zhǔn)確檢測(cè)是哪種病原而引起陽(yáng)性結(jié)果的問(wèn)題。

3.1.4 納米PCR 納米PCR是一種新型的PCR技術(shù)，敏感性高于常規(guī)PCR，可用于BVDV的快速檢測(cè)。劉澤余等[28]利用該技術(shù)對(duì)吉林省部分省界地區(qū)的血清樣品及臨床組織病料進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出150份陽(yáng)性血清樣品，BVDV陽(yáng)性率為19.21%。

3.1.5 重組聚合酶擴(kuò)增-側(cè)向試紙條檢測(cè) 該技術(shù)簡(jiǎn)稱為RPA-LFD。重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinant polymerase amplification,RPA)被認(rèn)為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)，侯佩莉等[29]針對(duì)BVDV 5’UTR序列，建立了一種BVDV RPA-LFD檢測(cè)方法，檢測(cè)限達(dá)2TCID50，與WOAH推薦的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)限一致。

3.2 核酸探針雜交技術(shù)

3.2.1 核酸探針雜交技術(shù) 廣泛應(yīng)用于病毒或細(xì)菌的基因檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)記物的不同，一般將核酸探針?lè)譃閮深悾阂活愂欠派湫酝凰貥?biāo)記探針(如32P等)，一類是非放射性物質(zhì)標(biāo)記核酸探針(如生物素、地高辛等)。因放射性同位素具有放射危害且半衰期短、不穩(wěn)定，目前BVDV的檢測(cè)常用的是非放射性物質(zhì)標(biāo)記核酸探針。雜交試驗(yàn)可以檢測(cè)CP型和NCP型毒株，且敏感性比BVDV感染試驗(yàn)強(qiáng)10倍～100倍[30]。值得注意的是，針對(duì)BVDV基因組不同區(qū)域的探針，檢測(cè)率存在差異，針對(duì)5’末端的探針檢出率高于其他區(qū)域[31-32]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，Heidari Z等[33]建立了交聯(lián)與非交聯(lián)金納米雜交試驗(yàn)，可直接檢測(cè)BVDV，無(wú)需擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度可達(dá)每反應(yīng)6.83 ng和44.36 ng，兩種方法成本低廉，操作簡(jiǎn)單，可用于BVDV臨床樣本的檢測(cè)。核酸探針雜交技術(shù)操作簡(jiǎn)便、特異性高、敏感性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，可在同一張膜上進(jìn)行幾個(gè)甚至上百個(gè)樣品的檢測(cè)，可用于BVDV大量樣本的快速檢測(cè)，但單個(gè)樣品的檢測(cè)成本較高。

3.2.2 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是分子雜交技術(shù)的發(fā)展，與傳統(tǒng)的核酸分子雜交技術(shù)相比，該方法可實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測(cè)，并能同時(shí)檢測(cè)多種病原，由于該方法的反應(yīng)體積小，大大降低了檢測(cè)成本，能用于BVDV大規(guī)模的檢測(cè)篩選。隨后，高峰等[34]將LAMP技術(shù)與微流控芯片技術(shù)有機(jī)結(jié)合，可同時(shí)檢測(cè)包括BVDV在內(nèi)的5種病原，為口岸檢疫探索出一種快速、高通量檢測(cè)動(dòng)物疫病的方法。而魏春霞等[35]建立了一種可視化基因芯片檢測(cè)方法，具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)，可在3 h內(nèi)完成同時(shí)對(duì)包括BVDV在內(nèi)的7種牛重要疫病病原的檢測(cè)，在牛群疫病診斷、凈化及流行病學(xué)調(diào)查等方面具有良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)語(yǔ)

BVDV是影響全球養(yǎng)牛業(yè)的主要?jiǎng)游镆卟〔≡唬谖覈?guó)感染范圍廣泛，且具有遺傳多樣性。準(zhǔn)確鑒別檢測(cè)BVDV，以了解該病在我國(guó)的流行現(xiàn)狀及主要流行毒株，同時(shí)篩查并清除PI牛，為我國(guó)BVD的防控及凈化提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。目前，診斷BVD的方法很多，每種方法都有適用性，也有局限性，應(yīng)根據(jù)檢測(cè)目的的差異，選擇不同的方法，如牛場(chǎng)臨床樣本的初篩可選擇瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)及RT-PCR;出入境口岸可選擇基因芯片技術(shù)、多重?zé)晒舛縍T-PCR等高通量檢測(cè)方法，可快速檢測(cè)多種病原;對(duì)于可疑樣本可選擇病毒分離培養(yǎng)、免疫熒光及電鏡檢查等方法進(jìn)行最終確定，并利用RT-PCR進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。實(shí)際工作中，往往選擇幾種檢測(cè)方法對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)，以避免假陽(yáng)性或非特異性結(jié)果的出現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信會(huì)有越來(lái)越多更加敏感、特異、快速的檢測(cè)方法的建立，為BVDV的精準(zhǔn)防控奠定基礎(chǔ)。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第5篇

題目：高壓氧在治療犬和貓腎衰竭中的應(yīng)用

慢性腎功能衰竭是在發(fā)生各種慢性腎臟疾病基礎(chǔ)上，由于腎單位逐漸受損，緩慢發(fā)展的腎功能減退以致不可逆轉(zhuǎn)的腎衰竭。該病主要表現(xiàn)為腎功能減退，代謝廢物(尤其是蛋白分解后的含氮代謝產(chǎn)物)潴溜，水、電解質(zhì)和酸堿平衡失調(diào)，與腎臟有關(guān)的多種內(nèi)分泌功能失調(diào)，以至于不能維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定而引發(fā)的臨床綜合征。慢性腎衰竭是犬和貓最常見(jiàn)腎臟疾病，是犬的第三大致死因素，貓的第二大致死因素，最常發(fā)生在5歲以上的犬和貓。高壓氧治療(hyperbaric oxygen therapy，HBOT)是在超過(guò)一個(gè)大氣壓的氧艙中呼吸純氧氣以達(dá)到治療目的治療方式。本文主要介紹臨床接診的30例腎衰竭病例，通過(guò)常規(guī)輸液治療配合高壓氧治療前后相關(guān)指標(biāo)的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 來(lái)我院就診的30例臨床腎衰竭，其中犬15例，貓15例。年齡最小2歲，最大12歲。

1.1.2 主要儀器 高壓氧艙，上海寶邦醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品;血?dú)夥治鰞x，雷度米特醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品;獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品;VET Chroma(維克瑪)熒光免疫分析儀，韓國(guó) ANIVET公司產(chǎn)品;全自動(dòng)生化分析儀，天津微納芯科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 一般檢查 精神沉郁，活動(dòng)力差，體況差(體況評(píng)分均小于4/9)。可視黏膜粉紅色，口臭，有牙齦炎及牙結(jié)石，毛細(xì)血管再充盈時(shí)間大于2 s，均出現(xiàn)不同程度脫水，皮膚被毛干燥，觸診淺表淋巴結(jié)正常。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 包括血常規(guī)檢查，急性反應(yīng)蛋白C反應(yīng)蛋白(淀粉樣蛋白)，血液生化，血?dú)獾取?/p>

1.2.3 治療 對(duì)上述病例進(jìn)行治療，治療主要包括常規(guī)治療和高壓氧治療。常規(guī)治療主要是根據(jù)個(gè)體情況進(jìn)行抗菌消炎，補(bǔ)充能量，糾正水、電解質(zhì)、酸堿平衡以及其他對(duì)癥治療。而高壓氧治療則按照每次高壓氧1 h，每日1次，5次為一療程，治療最短1個(gè)療程，最長(zhǎng)4個(gè)療程。15只貓和15條犬分別在1個(gè)療程后進(jìn)行相關(guān)血液項(xiàng)目檢測(cè)。

2 結(jié)果

患病動(dòng)物治療前血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，血液白細(xì)胞數(shù)升高及紅細(xì)胞數(shù)降低。C反應(yīng)蛋白(淀粉樣蛋白)含量均出現(xiàn)升高，最高為257.79 mg/L(正常指標(biāo)<10 mg/L)。治療后白細(xì)胞數(shù)及紅細(xì)胞數(shù)趨于正常，C反應(yīng)蛋白(淀粉樣蛋白)含量出現(xiàn)不同程度的降低。

15只貓和15條犬治療前后血液生化和血?dú)饨Y(jié)果見(jiàn)表1和表2。治療后腎臟指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度的降低，血?dú)鈾z測(cè)體內(nèi)酸中毒轉(zhuǎn)歸甚至消失，取得了較為滿意的治療效果。在治療過(guò)程中，8例死亡，15例指標(biāo)恢復(fù)正常，7例繼續(xù)堅(jiān)持高壓氧治療。

表1 治療前后部分生化腎功指標(biāo)對(duì)比

表2 治療前后血?dú)庵饕笜?biāo)對(duì)比

3 診療體會(huì)

高壓氧治療在人醫(yī)上應(yīng)用時(shí)間比較長(zhǎng)，近幾年才開(kāi)始進(jìn)入動(dòng)物診療。關(guān)于高壓氧在動(dòng)物治療應(yīng)用方面的文獻(xiàn)報(bào)道比較少，之前有報(bào)道的也是高壓氧在脊髓損傷、肺損傷、傷口愈合等方面的文獻(xiàn)[1-5]。

人醫(yī)上關(guān)于高壓氧治療腎臟疾病的研究比較早[6-7]。Ivanov M等[8]及商昌歡等[9]發(fā)現(xiàn)高壓氧對(duì)腎臟的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。其機(jī)制主要是通過(guò)增加血液中氧的物理溶解量，提高組織氧分壓，以糾正機(jī)體缺氧或促進(jìn)細(xì)胞有氧代謝，從而改善缺血組織的灌注情況、促進(jìn)損傷組織的恢復(fù)。從分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高壓氧可以減少腎小管上皮壞死細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用[10-14]。陳北方等[15]研究發(fā)現(xiàn)高壓氧可以增加血液和尿液中的SOD(腎臟抗氧化酶的一種)水平，從另一個(gè)方面解釋高壓氧治療慢性腎功能衰竭的可能機(jī)制。

在臨床治療犬和貓急慢性腎衰時(shí)，HBOT是首推的輔助治療方法之一。高壓氧治療使得腎功指標(biāo)和血?dú)庵笜?biāo)改善的可能機(jī)制是HBOT時(shí)腎血流減少，腎小球?yàn)V過(guò)率增加，有助于代謝廢物的清除和電解質(zhì)及酸堿平衡的維持;增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減少組織的氧化損傷;有利于修復(fù)和新生血管的生發(fā)，有利于腎臟局部微循環(huán)的重建及其功能的恢復(fù)。HBOT環(huán)境下使機(jī)體處于富氧狀態(tài)，能有效緩解缺血再灌注對(duì)腎臟的損傷，能促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝，對(duì)腎臟新生血管的生發(fā)和組織修復(fù)存在多方位的保護(hù)作用，有助于急慢性腎病的治療和轉(zhuǎn)歸。高壓氧與常規(guī)治療結(jié)合，加速病患愈合轉(zhuǎn)歸，起到事半功倍的效果。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第6篇

題目：抗雞球蟲(chóng)病基因重組疫苗的研究進(jìn)展

雞球蟲(chóng)病(Avian coccidiosis)是由頂復(fù)門(Apicomplexa)孢子綱(Sporozoasida)艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲(chóng)引起雞的一種腸道原蟲(chóng)病，球蟲(chóng)主要寄生于雞的腸上皮細(xì)胞內(nèi)，初次在禽類腸道發(fā)現(xiàn)距今已有100多年歷史，其對(duì)雞的危害十分嚴(yán)重。雞球蟲(chóng)病在世界各地均有發(fā)生每年造成的全球經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)35億美元[1]。雞感染球蟲(chóng)后會(huì)表現(xiàn)出血性、壞死性腸炎和血痢等癥狀[2]。同時(shí)，球蟲(chóng)的亞臨床感染也十分常見(jiàn)，多影響食物轉(zhuǎn)化率、平均日增重和出欄時(shí)間等關(guān)鍵生產(chǎn)參數(shù)。

目前雞球蟲(chóng)病的防控主要依賴化學(xué)抗球蟲(chóng)藥、活卵囊疫苗和飼養(yǎng)管理等策略。隨著抗雞球蟲(chóng)病藥物的大量使用，耐藥蟲(chóng)株日漸增多，藥物殘留等弊端也日益明顯，大大限制了抗雞球蟲(chóng)病藥物的應(yīng)用[3]。免疫預(yù)防在后抗生素時(shí)代逐漸成為控制雞球蟲(chóng)病的替代方法。目前的抗雞球蟲(chóng)病疫苗主要以強(qiáng)毒或減毒活卵囊疫苗為主，但二者都存在一定的缺陷[4]，強(qiáng)毒活卵囊疫苗不適當(dāng)?shù)氖褂每赡軙?huì)導(dǎo)致球蟲(chóng)病暴發(fā)或?qū)⑿碌膹?qiáng)毒球蟲(chóng)蟲(chóng)株引入養(yǎng)殖場(chǎng)，而弱毒活卵囊疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn);此外，所有活卵囊疫苗的應(yīng)用都屬于感染性免疫，存在影響免疫雞體腸道健康的潛在危機(jī)。因此，新一代安全高效的球蟲(chóng)防控策略亟待改善。

隨著各種基因工程技術(shù)的發(fā)展，疫苗研究的方向正逐漸從傳統(tǒng)滅活苗和弱毒苗向基因工程疫苗過(guò)渡。目前正在研發(fā)或已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的基因重組疫苗主要包括核酸疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和合成肽疫苗等[5]。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因重組疫苗具有安全、穩(wěn)定、高效、易于制備等特點(diǎn)。在本綜述中，總結(jié)了現(xiàn)有的抗雞球蟲(chóng)病措施，探索了可用于重組抗雞球蟲(chóng)病疫苗的候選方案。

1 當(dāng)前抗雞球蟲(chóng)病主要措施

1.1 抗雞球蟲(chóng)病藥物

大量研究表明，藥物仍是防治球蟲(chóng)病的主要措施與手段。當(dāng)前抗雞球蟲(chóng)病藥物(表1)包括聚醚類離子載體抗生素、化學(xué)合成藥[3]及中草藥。

表1 常用抗球蟲(chóng)藥

聚醚類離子載體抗生素由放線菌(Actinomaduraspp.)或鏈霉菌(Streptomycesspp.)發(fā)酵產(chǎn)生，主要作用于球蟲(chóng)無(wú)性繁殖與有性繁殖階段，通過(guò)干擾球蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子的正常交換，破壞細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，致使細(xì)胞死亡。由于其具有廣譜抗雞球蟲(chóng)病作用，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)雞業(yè)。

化學(xué)合成類抗雞球蟲(chóng)病藥主要通過(guò)抑制球蟲(chóng)線粒體呼吸作用、干擾球蟲(chóng)二氫葉酸的合成或競(jìng)爭(zhēng)性抑制硫胺攝取等方式來(lái)阻滯球蟲(chóng)的正常發(fā)育。

近年來(lái)，球蟲(chóng)對(duì)聚醚類抗生素和化學(xué)藥物的耐藥愈發(fā)普遍。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)各地的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)對(duì)聚醚離子載體類抗生素和化學(xué)抗雞球蟲(chóng)病藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性[6]。黃儀娟[7]等通過(guò)對(duì)分離得到的6株雞艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)6株蟲(chóng)株均呈現(xiàn)中度或重度耐藥。

盡管抗雞球蟲(chóng)病藥物在雞球蟲(chóng)病的防控中發(fā)揮著巨大作用，但不可避免的耐藥性問(wèn)題以及當(dāng)前全面減抗替抗背景下對(duì)抗雞球蟲(chóng)病藥物使用的限制，消費(fèi)者對(duì)食品中化學(xué)殘留物的擔(dān)憂，阻礙了大多數(shù)抗雞球蟲(chóng)病新藥的開(kāi)發(fā)。

1.2 活卵囊疫苗

艾美耳球蟲(chóng)活卵囊疫苗由未減毒或減毒的艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株研制而成，可以有效替代化學(xué)藥物用于預(yù)防雞球蟲(chóng)病，雞在攝入和循環(huán)受控劑量的疫苗卵囊后，可以獲得堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)[8]。由于疫苗株的生產(chǎn)需要通過(guò)在雞中獨(dú)立傳代多次，抗雞球蟲(chóng)病疫苗在家禽業(yè)的應(yīng)用受到了很大限制。對(duì)于生產(chǎn)能力的高要求，也意味著疫苗成本遠(yuǎn)高于抗雞球蟲(chóng)病藥[5]。

活卵囊疫苗也存在一定的缺陷。接種疫苗有引入新蟲(chóng)株的風(fēng)險(xiǎn);活卵囊會(huì)引起雞輕微腸道病變，影響飼料轉(zhuǎn)化率;由于球蟲(chóng)卵囊較大，易沉積，添加懸浮劑后若不混勻，極易造成免疫不均，影響免疫效果。在免疫期間禁止使用抗球蟲(chóng)藥，飼料中也不能含有抗球蟲(chóng)藥物。以上因素的存在限制了球蟲(chóng)疫苗在養(yǎng)殖戶中的廣泛應(yīng)用。

1.3 基因重組疫苗

基因重組疫苗主要有核酸疫苗、亞單位疫苗和活載體疫苗等 。核酸疫苗是將含有編碼抗原基因序列的質(zhì)粒載體，通過(guò)肌肉注射或用基因槍等導(dǎo)入宿主體內(nèi)，被宿主的組織細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞或其他炎性細(xì)胞攝取，抗原蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而達(dá)到防治疾病的目的[9]。亞單位疫苗是通過(guò)基因重組技術(shù)，調(diào)取病原微生物保護(hù)性抗原基因并導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，在其高效表達(dá)后提取保護(hù)性抗原，加入佐劑制成的重組亞單位疫苗[10]。CoxAbic是第一個(gè)商業(yè)化的球蟲(chóng)病亞單位疫苗。由從巨型艾美耳球蟲(chóng)(E.maxima)分離到的親和純化的配子母細(xì)胞抗原(affinity purified sexual stage (gametocyte) antigens,APGA)組成[11]。接種蛋雞后其抗球蟲(chóng)作用可通過(guò)蛋垂直傳播給下一代。活載體疫苗主要是利用分子生物學(xué)手段，將目的抗原的編碼基因?qū)爰?xì)菌或病毒活載體，隨著重組菌(毒)株在宿主體內(nèi)增殖，目的基因大量表達(dá)，從而誘發(fā)相應(yīng)的免疫保護(hù)應(yīng)答[12]。自20世紀(jì)80年代有關(guān)于重組疫苗開(kāi)發(fā)的報(bào)道以來(lái)，多個(gè)研究小組已經(jīng)嘗試和試驗(yàn)了多種候選抗原。據(jù)報(bào)道，在免疫球蟲(chóng)抗原重組蛋白、重組球蟲(chóng)抗原DNA疫苗及聯(lián)合病毒活載體的球蟲(chóng)抗原疫苗的小規(guī)模試驗(yàn)中，球蟲(chóng)卵囊計(jì)數(shù)或腸道損傷評(píng)分降低了30%～90%，或者在飼料轉(zhuǎn)化率或相對(duì)增重率方面得到了改善[13]。

2 抗雞球蟲(chóng)病基因重組疫苗研究進(jìn)展

當(dāng)前抗雞球蟲(chóng)病基因重組疫苗的研究主要集中于抗原蛋白的選擇與細(xì)胞因子佐劑的聯(lián)合使用。同時(shí)，艾美耳球蟲(chóng)復(fù)雜的抗原多樣性對(duì)基因重組疫苗的研制造成了一定的阻礙，選擇合適的抗原是開(kāi)發(fā)新型基因重組疫苗的關(guān)鍵。

2.1 候選抗原蛋白分子研究進(jìn)展

在宿主與蟲(chóng)體互作中發(fā)揮重要作用的蛋白被確定為抗雞球蟲(chóng)病疫苗候選蛋白，這是由于這些蛋白在球蟲(chóng)入侵與增殖過(guò)程中自然暴露，因此可以作為宿主免疫應(yīng)答的靶標(biāo)[10]。

研究最廣泛的是微線體蛋白，微線體位于頂復(fù)門寄生蟲(chóng)頂端，可分泌頂膜抗原(apical membrane antigen,AMAs)、微線體蛋白(microneme proteins,MICs)等，對(duì)寄生蟲(chóng)的滑行運(yùn)動(dòng)與黏附宿主細(xì)胞以及進(jìn)出受感染細(xì)胞至關(guān)重要[14]。MICs在入侵早期分泌，幫助寄生蟲(chóng)附著于宿主細(xì)胞，為入侵創(chuàng)造平臺(tái)[15]。對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AMAs蛋白在子孢子階段和裂殖子階段均存在。研究發(fā)現(xiàn)AMA1是子孢子入侵宿主的關(guān)鍵蛋白，是形成蟲(chóng)體與宿主細(xì)胞間環(huán)形運(yùn)動(dòng)結(jié)合體(moving junction,MJ)不可缺少的一部分[16]。

SO7蛋白又稱RB1或GX3262，位于子孢子折光體上，作為重組蛋白、核酸疫苗或以鼠傷寒沙門氏菌為載體時(shí)，可誘導(dǎo)部分保護(hù)性免疫。研究發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳蟲(chóng)重組折光體蛋白EtSO7能有效誘導(dǎo)免疫雞產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，對(duì)盲腸感染球蟲(chóng)的雞有明顯的保護(hù)作用[17]。

TA4蛋白位于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子表面，研究發(fā)現(xiàn)抗TA4抗原的單克隆抗體會(huì)對(duì)雞球蟲(chóng)子孢子入侵細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，表明TA4抗原可能在球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。近年來(lái)大量研究也證實(shí)，以 TA4 基因編碼的蛋白免疫雞只，能夠收到良好的抗球蟲(chóng)效果。IMP1定位于子孢子細(xì)胞膜，現(xiàn)已作為候選抗原被廣泛研究。近年來(lái)，IMP1蛋白被先后確定為巨型艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的疫苗候選分子[19-20]。3-1E蛋白是研究最多的抗雞球蟲(chóng)病亞單位疫苗抗原。其主要與肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合，延緩肌動(dòng)蛋白聚合作用，同時(shí)也在弓形蟲(chóng)的滑行運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用。它還是Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)5、11和12的配體，這些受體在許多胞內(nèi)病原微生物(如弓形蟲(chóng))的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]，這表明3-1E蛋白可作為一種新的黏膜佐劑。研究發(fā)現(xiàn)免疫艾美耳球蟲(chóng)3-1E蛋白增強(qiáng)了小鼠對(duì)急性靜脈病毒感染的抵抗力[22]。將艾美耳球蟲(chóng)3-1E蛋白、產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB蛋白與Montanide IMS佐劑聯(lián)合應(yīng)用，在巨型艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染動(dòng)物試驗(yàn)中，增強(qiáng)了對(duì)于壞死性腸炎的抵抗效果[23]。

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)作為無(wú)氧糖酵解途徑的末端酶，對(duì)寄生蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的生命活動(dòng)有較大影響。研究表明，每種球蟲(chóng)僅有一種LDH，因此常被用以鑒別艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)種。分析柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)、巨型艾美耳球蟲(chóng)(E.maxima)和堆型艾美耳球蟲(chóng)(E.acervulina)的LDH氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其同源性為66%～80%，且其蛋白表達(dá)水平在球蟲(chóng)發(fā)育各階段無(wú)明顯差異，具有作為疫苗候選抗原的潛力[24]。

2.2 細(xì)胞因子佐劑研究進(jìn)展

細(xì)胞因子具有廣泛的生物學(xué)活性，在調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，由抗原或其他刺激劑誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生。大量研究表明將細(xì)胞因子作為佐劑與球蟲(chóng)疫苗聯(lián)合使用，可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性，增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)力和機(jī)體的免疫水平。通過(guò)將球蟲(chóng)保護(hù)性抗原與相應(yīng)細(xì)胞因子連接構(gòu)建表達(dá)載體，可以有效改善基因重組疫苗的缺點(diǎn)。

白介素(IL-2、IL- 12、IL-18)、干擾素(IFN-α、IFN-γ)和腫瘤生長(zhǎng)因子(tumor growth factor,TGF)b4等被廣泛用作基因重組疫苗的佐劑。在加入IFN-α和淋巴細(xì)胞趨化因子后，感染堆型艾美耳球蟲(chóng)雞的飼料轉(zhuǎn)化率得到了顯著提高，而IL-1β、IL-8、IL-15、IFN-γ、TGFb4和淋巴細(xì)胞趨化因子則可降低球蟲(chóng)的復(fù)制。細(xì)胞因子的劑量和類型也會(huì)影響局部免疫反應(yīng)的質(zhì)量。研究表明，聯(lián)合注射pcDNA3.1-IL-2重組質(zhì)粒對(duì)雞球蟲(chóng)疫苗免疫具有增效作用[25]。近年來(lái)，IL-2被證實(shí)可與多種艾美耳球蟲(chóng)抗原相結(jié)合，如TA4、SO7以及堆型艾美耳球蟲(chóng)抗原cSZ-2，表明IL-2的聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)基因重組疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果。

2.3 抗原多樣性

了解球蟲(chóng)基因組遺傳多樣性的程度與研究其野外生存和進(jìn)化能力高度相關(guān)。在外界選擇壓力的變化下，適應(yīng)的速度對(duì)球蟲(chóng)的生存至關(guān)重要，常受到遺傳多樣性的影響。Emily等[26]對(duì)248條來(lái)源于堆型、巨型和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的ITS1-5.8S-ITS2序列的固定系數(shù)(FST)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明其存在顯著的種內(nèi)多樣性，其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)可能存在地域差異。艾美耳球蟲(chóng)的遺傳多樣性和復(fù)雜的生命周期使基因重組疫苗的研制成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)[27]。

迄今為止，各界學(xué)者僅對(duì)少數(shù)艾美耳球蟲(chóng)的候選疫苗抗原進(jìn)行了詳細(xì)的序列分析以確定其多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巨型艾美耳球蟲(chóng)頂膜抗原EmAMA1作為DNA疫苗或細(xì)菌載體重組蛋白疫苗進(jìn)行免疫時(shí)，可誘導(dǎo)強(qiáng)大的同源免疫保護(hù)作用[19]。此外，對(duì)來(lái)自中國(guó)、埃及、德國(guó)、印度、日本、利比亞、尼日利亞、英國(guó)、美國(guó)和委內(nèi)瑞拉的56份柔嫩艾美耳球蟲(chóng)現(xiàn)場(chǎng)樣本的EtAMA1編碼序列分析顯示，該樣本存在中度多態(tài)性，與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的全基因組多樣性形成鮮明對(duì)比[28]，說(shuō)明AMA1是一種良好的候選疫苗抗原。李靈娟[29]通過(guò)分析從毒害和堆型艾美耳球蟲(chóng)中克隆到的NA4和3-1E抗原基因，發(fā)現(xiàn)NA4抗原與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的TA4抗原之間基因序列的同源性達(dá)91.4%，氨基酸序列的同源性為86%;3-1E抗原在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和堆型艾美耳球蟲(chóng)之間的基因序列同源性達(dá)99.8%，氨基酸序列的同源性為99.4%，動(dòng)物交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)證明兩種抗原對(duì)4種艾美耳球蟲(chóng)均有部分交叉免疫保護(hù)作用，說(shuō)明這2種抗原有可能作為艾美耳球蟲(chóng)交叉免疫保護(hù)性DNA疫苗的候選抗原。

抗原多樣性會(huì)影響針對(duì)頂復(fù)門原蟲(chóng)如惡性瘧原蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)性疫苗的效力。由抗原多樣性導(dǎo)致的免疫逃避在堆型、巨型、和緩以及柔嫩艾美耳球蟲(chóng)中均有發(fā)現(xiàn)。因此，詳細(xì)了解編碼候選疫苗抗原的基因多樣性是選擇最優(yōu)候選疫苗抗原的關(guān)鍵。

3 影響免疫效果的因素

3.1 免疫途徑

由于免疫途徑不同，參與免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞也不同，可能會(huì)對(duì)疫苗的免疫保護(hù)效果造成一定影響。免疫途徑的選擇應(yīng)考慮多方面的因素，如接種部位細(xì)胞呈遞抗原的能力、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率、抗原基因的體內(nèi)表達(dá)水平和宿主易感性等。基因重組疫苗的免疫途徑主要有注射、口服、點(diǎn)眼滴鼻、噴霧、電穿孔和基因槍技術(shù)等。研究發(fā)現(xiàn)，核酸疫苗腿部肌肉注射的效果最優(yōu)，且抗雞球蟲(chóng)病指數(shù)最高[30]，說(shuō)明肌肉注射是一種簡(jiǎn)單有效的免疫途徑。若以志賀氏菌、沙門氏菌、李斯特氏菌作為球蟲(chóng)基因重組疫苗的載體，可采用口服免疫、鼻內(nèi)滴注或鼻腔噴霧等方法提高粘膜免疫應(yīng)答，但存在一定局限性。

3.2 免疫劑量

免疫應(yīng)答強(qiáng)度和免疫保護(hù)力與免疫劑量有關(guān)。周賽等[31]將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Mic4-N端蛋白在重組酵母中表達(dá)，與AbISCO?-100佐劑結(jié)合后進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)10 μg蛋白+50 μg佐劑組CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞百分率顯著升高，增重顯著升高，腸道病變計(jì)分、糞便OPG值顯著降低，證明免疫劑量是影響抗球蟲(chóng)效果的因素之一。趙勝杰[32]制備了針對(duì)多種艾美耳球蟲(chóng)的混合DNA疫苗，其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的最佳免疫劑量為10 μg，而另外3種球蟲(chóng)的最佳免疫劑量均為25 μg，說(shuō)明對(duì)于不同種的艾美耳球蟲(chóng)，疫苗的最佳免疫劑量也不相同。

3.3 免疫次數(shù)

由于基因重組疫苗在體內(nèi)表達(dá)量低、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，免疫次數(shù)對(duì)免疫效果有很大影響。李祥瑞等[33]將含有生長(zhǎng)激素基因的質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠表皮細(xì)胞后，88%的被免小鼠產(chǎn)生了抗體，二次加強(qiáng)免疫后抗體水平明顯提高。顧有方等[34]研究了GC02雞球蟲(chóng)病疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，二次免疫的效果最優(yōu)，可有效控制雞球蟲(chóng)病的發(fā)生，且能明顯促進(jìn)雛雞的生長(zhǎng)。說(shuō)明在初次免疫后，再次或多次加強(qiáng)免疫，可有效提高體液免疫或細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

4 展 望

近年來(lái)，隨著公眾對(duì)食品安全的重視以及病原耐藥性的問(wèn)題，疫苗已代替藥物成為球蟲(chóng)病防控的流行趨勢(shì)。相較于活卵囊疫苗，基因重組疫苗制作成本更低，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平保護(hù)性免疫，已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。不同發(fā)育階段的球蟲(chóng)，其抗原組成與免疫原性也不同，因此，將不同球蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因連接到表達(dá)載體中，構(gòu)建多價(jià)多表位基因重組疫苗將是未來(lái)基因重組疫苗研究的趨勢(shì)。此外，利用細(xì)胞因子構(gòu)建免疫調(diào)節(jié)型基因重組疫苗可以提高抗原呈遞效率，增強(qiáng)免疫效果，具有較好的應(yīng)用前景。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第7篇

題目：基層獸醫(yī)豬病料常用采集操作技術(shù)

摘要：本文就基層獸醫(yī)豬病料采集的原則進(jìn)行了介紹，提出了不同病料常用的采集操作技術(shù)，希望能夠?yàn)榛鶎荧F醫(yī)提供參考以及借鑒，不斷提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：基層獸醫(yī);豬;病料;采集;原則;技術(shù)

基層獸醫(yī)在日常對(duì)豬病診斷過(guò)程中，常常會(huì)遇到很難通過(guò)感官確診或者定性的疾病，此時(shí)需要采取實(shí)驗(yàn)室診斷方法確診。在實(shí)驗(yàn)室診斷前，首先需要采集病料，只有掌握豬病料采集技術(shù)要點(diǎn)，嚴(yán)格并且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)施病料采集，才可保證疫病監(jiān)測(cè)以及治療工作的順利開(kāi)展。

1 病料采集的原則

1.1無(wú)菌采集。在病料采集過(guò)程中，必須保證全程無(wú)菌操作。尤其是需要進(jìn)行血清學(xué)檢查以及微生物檢查的樣本。所采用容器以及器械等必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的消毒處理，嚴(yán)格按照相關(guān)無(wú)菌操作規(guī)程進(jìn)行操作。

1.2典型性。應(yīng)保證所采集用于檢疫的飼料具備代表性以及針對(duì)性。結(jié)合病害流行的特點(diǎn)明確需要采集病料的種類，在此基礎(chǔ)上選擇病料組織、分泌物以及排泄物等。

在此過(guò)程中需要注意，在選取動(dòng)物過(guò)程中需要遵循典型性原則，保證所選擇動(dòng)物沒(méi)有經(jīng)過(guò)藥物治療，其臨床癥狀具備代表性，在檢查細(xì)菌性傳染性疾病時(shí)尤為重要。

另外，選取病料時(shí)也需遵循典型性原則，盡可能選擇病原體含量較高的病料。在準(zhǔn)備采集病料前，首先需要對(duì)感染病害進(jìn)行初步診斷，重點(diǎn)對(duì)常常受到病原體侵害的部位采集。

1.3適時(shí)性。應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確把握病料的采集時(shí)間，尤其在夏季需要將采集時(shí)間控制在4h以內(nèi)。如果采集時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，常常會(huì)導(dǎo)致病料組織發(fā)生腐爛現(xiàn)象，很難檢測(cè)出原有病原組織。如果情況所需，應(yīng)對(duì)早期發(fā)病的活體組織進(jìn)行急宰并采集病料組織[1]。

1.4安全采集。在樣本采集過(guò)程中，必須保證操作的安全性，在防止人員受到感染的同時(shí)避免因病原菌發(fā)生擴(kuò)散而導(dǎo)致感染面積的增大。如果病豬為疑似炭疽病，不得立即為其剖檢，而是需要切開(kāi)其頸靜脈處的皮膚，將少量血液抽出后制作壓片以開(kāi)展血片檢查。

2 病料采集操作技術(shù)

2.1 采集前準(zhǔn)備。

2.1.1 人員。在病料采集前，必須對(duì)采集人員開(kāi)展相關(guān)業(yè)務(wù)培訓(xùn)工作，保證其具備足夠的生物安全意識(shí)。例如，如果病豬患有疑似非洲豬瘟疫情，采集人員在采集之前必須明確掌握非洲豬瘟傳播、感染以及預(yù)防相關(guān)知識(shí)，同時(shí)能夠?qū)ιi進(jìn)行熟練保定病采集病料。

2.1.2 物品。結(jié)合需要采集的病料制定一個(gè)科學(xué)合理的采集計(jì)劃，同時(shí)做好所需物品的準(zhǔn)備工作。通常情況下，需要為采集操作準(zhǔn)備各種類型的手術(shù)器械、病料包裝袋、容器以及消毒劑等。

對(duì)于在病料采集過(guò)程中需要使用的各種手術(shù)器械，必須提前在121℃下高壓滅菌30min。對(duì)于注射器、采血針以及采血管等，需要使用一次性無(wú)菌制品;如果不具備一次性物品，必須再使用前落實(shí)無(wú)菌處理。對(duì)病料采集過(guò)程中需對(duì)70%的酒精、福爾馬林固定液、保存液、其他消毒液等各種所需溶液進(jìn)行配制。另外，還需提前準(zhǔn)備防護(hù)服、防護(hù)口罩、無(wú)菌手套、病料采集單、記號(hào)筆、護(hù)目鏡以及膠靴等。

2.1.3 環(huán)境。在采集病料之前，首先需要選擇最為適宜的病料采集位置，同時(shí)對(duì)病料采集環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格的消毒。嚴(yán)格處理各種廢棄物，防止病毒傳播擴(kuò)散，避免發(fā)生污染。

在病料采集過(guò)程中所使用的手術(shù)刀片以及注射器針頭等在使用完畢后需要立即置于封閉的銳器盒內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)害化處理;對(duì)于一次性防護(hù)用品以及注射器等，則需置入密封袋無(wú)害化處理。

在病料采集工作結(jié)束后，需要及時(shí)采用消毒劑對(duì)動(dòng)物尸體進(jìn)行噴灑消毒，接著裝入密封袋中無(wú)害處處理。采集人員需要更衣消毒，對(duì)環(huán)境進(jìn)行有效的清潔以及徹底的消毒。

2.2 病料采集方法。采集人員需要嚴(yán)格按照相關(guān)操作規(guī)程開(kāi)展病料采集工作。

2.2.1 血液采集。豬只不僅脂肪層較厚，同時(shí)具備較厚的肌肉層，通常情況下很難直接觸及其血管，因而對(duì)其采集血液難度較大。在臨床上，血液采集方法較多，但是要想在獲取大量血液的同時(shí)使采血速度得到保障，通常采用頸靜脈采血方式以及前腔靜脈采血方式。可以結(jié)合豬只大小等各種客觀因素靈活選擇適宜的采血方法[2]。

(1)頸靜脈采血。對(duì)豬只進(jìn)行站立式保定，保證被保定豬只頭部處于垂直上舉狀態(tài)，同時(shí)身體與頭部垂直不存在扭曲現(xiàn)象。操作人員需要從豬只頸靜脈溝處將針刺入，對(duì)著微偏中心線背部方向抽取血液。

(2)前腔靜脈。與頸靜脈采血方式采取同樣的保定方法。在保定好后，豬只頸根部以及胸骨之間會(huì)出現(xiàn)一個(gè)凹陷窩。在采血過(guò)程中，將針頭對(duì)著凹陷窩的位置刺入，刺入方向?yàn)橐粋?cè)肩胛骨頂端方向。另外，病豬機(jī)體左側(cè)內(nèi)，心臟以及膈肌內(nèi)存在著較多的迷走神經(jīng)，但是其右側(cè)較少。在扎針過(guò)程中，一旦碰到迷走神經(jīng)，常常會(huì)導(dǎo)致豬只出現(xiàn)抽搐以及呼吸困難等各種癥狀。因而，在采血過(guò)程中在凹陷窩位置入針以后將插針?lè)较蚩刂圃谙蛴壹珉喂欠较颉?/p>

(3)血液處理方法。在病原學(xué)檢測(cè)過(guò)程中，需要采用具備抗凝功能的血液。在采集過(guò)程中，所采用真空采血管內(nèi)應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加入了枸櫞酸鈉、EDTA或者肝素等各種抗凝劑，或者抽取果抗凝劑浸潤(rùn)過(guò)的注射器。嚴(yán)禁對(duì)所采集血液進(jìn)行冷凍保存，將其保存溫度控制在2-10℃，嚴(yán)格控制保存時(shí)間，不得超過(guò)24h。如果保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，紅細(xì)胞極容易發(fā)生變形或者破裂，使顯微鏡的觀察受到影響。

如果需要進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，在檢測(cè)之前首先需要制備血清。通常情況下通過(guò)離心分離來(lái)制備血清，在離心之前，需要將血液保存于溫度為4℃的冰箱內(nèi)2h，以促進(jìn)血清的析出[3]。離心過(guò)程中，將離心機(jī)的轉(zhuǎn)速控制在2000r/min，離心時(shí)間控制在10min。另外，也可以將血液在采血管內(nèi)自然放置12-24h從而將血清析出。可以采用冷凍方式對(duì)血清進(jìn)行保存，但是冷凍保存方式保存時(shí)間不宜超過(guò)7天。在此過(guò)程中需要注意，反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致血清內(nèi)物質(zhì)的活性遭到破壞，使評(píng)價(jià)工作受到影響。

2.2.2 組織采集方法。在組織病料采集過(guò)程中，需要遵循無(wú)菌操作，保證一畜一套器械。在采集心臟、淋巴結(jié)、腎臟以及脾臟等病變臟器組織時(shí)，必須保證操作迅速，尤其是在氣溫較高的夏季，需要將采集時(shí)間控制在4h內(nèi)，如果采集時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織器官常常會(huì)發(fā)生自溶、腐敗以及變性等各種情況，使檢驗(yàn)效果受到影響。在活體病料采集過(guò)程中，如果為多只動(dòng)物發(fā)病，首先對(duì)存在明顯癥狀的豬只采集。需要將所采集病料置于50%的甘油緩沖液內(nèi)保存并送檢。如果需要開(kāi)展病理組織學(xué)檢查，需要將所采集組織置于95%的酒精中或者福爾馬林溶液當(dāng)中。固定組織以及固定液的體積比為1：10，通常在固定后24h需要對(duì)固定液進(jìn)行1次更換。對(duì)待送檢病料進(jìn)行編號(hào)，同時(shí)做好其記錄工作。妥善包裝送檢病料，例如組織病料以及血液需要冷藏保存，而病理學(xué)材料不得冰凍。

2.2.3 尿液。在豬只排尿過(guò)程中，采取一次性塑料杯接取其尿液。

2.2.4 糞便。采用無(wú)菌棉拭子從豬只直腸內(nèi)或者肛門內(nèi)壁部位沾取新鮮的糞便，接著將棉拭子置于密封袋內(nèi)，在此過(guò)程中折斷并舍棄手拿捏棉拭子柄的位置，以防所采集糞便受到污染[4]。

2.2.5 鼻分泌物。采用無(wú)菌棉拭子沾取豬只鼻腔內(nèi)或者鼻鏡內(nèi)的黏液。接著采用與糞便采集同樣的方式將其置于密封袋內(nèi)。

2.2.6 皮膚。采用鋒利的外科刀具從病變皮膚部位刮取皮屑、結(jié)痂以及毛發(fā)等并置于容器內(nèi)。

2.2.7 乳汁。采用消毒液對(duì)乳房、乳房附近毛發(fā)進(jìn)行消毒。棄取最初幾股乳汁，接著采集10-20ml乳汁并置于滅菌容器當(dāng)中。

參考文獻(xiàn)

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動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第8篇

題目：奶牛乳房炎診斷方法研究進(jìn)展

乳制品已成為人民日常生活不可或缺的主要食品，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展與奶牛養(yǎng)殖業(yè)密不可分。奶牛乳房炎(bovine mastitis，BM)是嚴(yán)重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一[1]，其診斷技術(shù)水平直接反映國(guó)家畜牧業(yè)發(fā)展水平和科技實(shí)力。本文主要論述了不同診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并思考了如何將診斷技術(shù)更好地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，以期為防治該病和開(kāi)發(fā)診斷新技術(shù)提供參考。

1 奶牛乳房炎概況

1.1 流行現(xiàn)狀及危害

奶牛乳房炎又稱奶牛乳腺炎，是乳腺受到物理、化學(xué)、致病微生物以及其他因素所引起的一種炎性變化，主要表現(xiàn)為乳汁理化性質(zhì)改變、體細(xì)胞數(shù)變化以及乳腺組織病理學(xué)變化。據(jù)報(bào)道，全世界每年因乳房炎經(jīng)濟(jì)損失達(dá)350億美元，僅美國(guó)奶業(yè)損失每年可達(dá)20多億美元，在我國(guó)奶牛乳房炎發(fā)病率約為46%～70%[2]。其危害主要體現(xiàn)在以下幾方面：(1)可致泌乳量降低10%～15%及乳質(zhì)量變差，治療不當(dāng)可致終身不產(chǎn)乳[3]。(2)影響繁殖性能且導(dǎo)致奶牛淘汰率達(dá)9%～10%[4]。(3)病牛乳汁含有非乳源性雜質(zhì)或治療的抗生素等藥物殘留，影響食品安全。

1.2 分類及發(fā)病機(jī)制

根據(jù)乳汁肉眼可見(jiàn)變化，可分為臨床型乳房炎(clinical mastitis，CM)、隱性乳房炎(subclinical mastitis，SM)和慢性乳房炎。根據(jù)發(fā)病特點(diǎn)和病理變化又分為漿液性乳房炎、卡他性乳房炎、纖維蛋性乳房炎、出血性乳房炎、化膿性乳房炎、壞疸性乳房炎。

乳房炎發(fā)生主要包括3個(gè)時(shí)期[5]：(1)因各種不良因素，致使病原菌從乳頭口入侵乳頭管;(2)病原菌侵入乳腺組織后，在乳房?jī)?nèi)繁殖進(jìn)而導(dǎo)致重復(fù)感染;(3)乳腺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。

2 奶牛乳房炎診斷技術(shù)

2.1 病原菌分離

病原菌分離常被認(rèn)為是傳統(tǒng)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，分離培養(yǎng)出的病原菌對(duì)于抗生素選擇使用有許多優(yōu)勢(shì)。但該方法對(duì)隱性乳房炎鑒定準(zhǔn)確性低、耗時(shí)長(zhǎng)、變異性較大，易出現(xiàn)假陰性。

2.2 體細(xì)胞計(jì)數(shù)法

體細(xì)胞計(jì)數(shù)法有直接和間接計(jì)數(shù)法兩種。直接計(jì)數(shù)法主要用儀器進(jìn)行測(cè)定，如利拉伐細(xì)胞計(jì)數(shù)器、Fossomatic 細(xì)胞計(jì)數(shù)器等簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，可自動(dòng)地分析大量樣本。但花費(fèi)高，使用不普遍。

間接計(jì)數(shù)法主要是破壞乳汁中體細(xì)胞，使其釋放核酸物質(zhì)，進(jìn)一步反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生沉淀或凝膠。研究表明，乳汁體細(xì)胞數(shù)低于2×105個(gè)/mL為陰性，在2×105個(gè)/mL～5×105個(gè)/mL之間為可疑，大于或等于5×105個(gè)/mL則判定為隱性乳房炎[6]。基于此原理，常用的有美國(guó)加州乳房炎診斷試劑(CMT)，但其準(zhǔn)確度(87.4%～90.8%)較低。在我國(guó)也有蘭州(LMT)、北京(BMT)和杭州(HMT)等診斷試劑。該方法較為費(fèi)力且不適合初乳期和泌乳后期，在大型奶牛場(chǎng)中可作為輔助診斷。

2.3 分子生物學(xué)診斷

分子生物學(xué)技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和多重實(shí)時(shí)PCR等，可檢測(cè)引起亞臨床乳房炎的病原體或其遺傳物質(zhì)。PCR一般以16S～23S rRNA間隔保守區(qū)為擴(kuò)增序列。希尼尼根等[7]建立了可同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、牛支原體的多重PCR方法，該方法敏感性分別為10 pg/μL、1 pg/μL和10 pg/μL。

LAMP具有鈣黃綠素介導(dǎo)的量熱無(wú)線檢測(cè)系統(tǒng)，可在65 min內(nèi)有效檢測(cè)病原體，更適用于金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)[8]。Kawai等[9]選擇引起乳房炎的12個(gè)屬的病原微生物，利用32個(gè)引物以及能同時(shí)檢測(cè)所有病原的DNA芯片，通過(guò)LAMP優(yōu)化DNA擴(kuò)增條件，與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果相比，當(dāng)培養(yǎng)法設(shè)置為100%時(shí)，DNA芯片的總陽(yáng)性率為85.0%，總陰性率為86.9%，此方法可快速準(zhǔn)確檢測(cè)到乳房炎的病原。

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR是傳統(tǒng)PCR的改進(jìn)，利用熒光信號(hào)積累對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。張莉莉等[10]針對(duì)大腸埃希氏菌、無(wú)乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的保守序列設(shè)計(jì)合成了3套特異性引物,通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法,最低檢測(cè)濃度分別為102、103、104拷貝數(shù)/μL,敏感性較高，DNA各個(gè)拷貝數(shù)濃度變異系數(shù)均低于2.02%，重復(fù)性良好，具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，PCR診斷技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高、操作方便、耗時(shí)短且誤差小。

2.4 生物物理技術(shù)診斷

電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和紅外熱成像(IRT)均能顯著促進(jìn)乳腺炎相關(guān)病原菌的鑒定，允許從物種水平對(duì)細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。Magro等[11]研究，基于質(zhì)譜原理的MALDI-TOFMS可在極短時(shí)間內(nèi)測(cè)定細(xì)菌種類或其蛋白質(zhì)。該技術(shù)特異性強(qiáng)和靈敏度高，能替代或補(bǔ)充通過(guò)表型方法進(jìn)行鑒定，但僅適用于現(xiàn)有細(xì)菌蛋白質(zhì)譜的特定光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，如廣泛使用不太經(jīng)濟(jì)。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)基于對(duì)全生物體DNA鑒定，通過(guò)被測(cè)物種的光譜與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中已知物種的光譜進(jìn)行比對(duì)，可在亞種或品系水平上區(qū)分乳房炎病原體生物，分別使用FTIR和MALDI-TOF MS方法鑒定牛乳腺炎相關(guān)的革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性球菌，其正確率分別為100%和90.5%，前者略優(yōu)于質(zhì)譜法[12-13]。

紅外熱成像(IRT)基于皮膚或乳房表面的熱或溫差，以圖像形式反映。其高靈敏度熱感相機(jī)可檢測(cè)乳房表面溫度的微小變化或炎癥，通過(guò)移動(dòng)信息技術(shù)應(yīng)用，可以成為一個(gè)便攜式診斷工具[14]，其敏感性和特異性分別為95.6%和93.6%[15]。其敏感性和特異性雖然很高，但在實(shí)際操作中難度大，有待進(jìn)一步研究。

2.5 基于傳感器的乳房炎診斷

在診斷領(lǐng)域，監(jiān)測(cè)奶牛乳房炎發(fā)病時(shí)或發(fā)病前行為變化極其重要。奶牛在采食量和整體活動(dòng)方面變化顯著，這些疾病跡象在臨床癥狀出現(xiàn)前幾天就很明顯，因此可作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)。Chinnappan等[16]基于磁性納米顆粒，通過(guò)使用纖溶酶的蛋白水解活性作為生物標(biāo)記，開(kāi)發(fā)了一種特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌的比色生物傳感器，其靈敏度在體外測(cè)定為1 ng/mL纖溶酶。該方法能區(qū)分健康乳和病乳，且在乳房炎診斷過(guò)程中反應(yīng)迅速、簡(jiǎn)單、靈敏、潛力大，可用作初始診斷。

2.6 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

蛋白質(zhì)組學(xué)方法在診斷、預(yù)測(cè)和預(yù)防奶牛乳房炎以及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量方面非常有用。這種方法有助于鑒定乳房?jī)?nèi)感染(IMI)生物標(biāo)志物[17-19]。研究表明，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)就是一種重要的BM炎癥標(biāo)志物，基于此可對(duì)全乳復(fù)雜基質(zhì)進(jìn)行分析[20]。一些組合策略液已被用于奶牛乳房炎期間牛奶的蛋白質(zhì)組分析，如雙向凝膠電泳后的MALDI-TOFMS(2D-GE)，液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)合應(yīng)用。Abdelmegid等[17]采用二維差異凝膠電泳(2D-DIGE )結(jié)合液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，從具有肥大癥狀的病乳中檢測(cè)到28種高豐度蛋白，其中9種具有宿主防御功能，這些蛋白包括參與先天免疫和抗菌功能的急性期蛋白以及與病原體免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白，可成為奶牛隱性乳房炎潛在的候選生物標(biāo)志物。

2.7 特異性免疫分析

根據(jù)抗原抗體反應(yīng)特性，免疫檢測(cè)成為診斷亞臨床乳腺炎的有效方法，如乳膠凝集法、免疫層析法[21]。Jaeger等[22]利用牛乳淀粉樣蛋白A作為檢測(cè)亞臨床乳房炎的生物標(biāo)志物，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果對(duì)主要病原體檢測(cè)靈敏度為81.4%、特異性為93.4%，對(duì)全病原體檢測(cè)靈敏度為88.0%、特異性為65.2%。與常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相比，基于磁珠的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具有快速、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)試劑少的優(yōu)勢(shì)。但可能存在由于交叉反應(yīng)導(dǎo)致非特異性高缺點(diǎn)。此外，成本較高，對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施和人員技術(shù)熟練的要求高。

2.8 基因測(cè)序分析

基因分型、指紋識(shí)別已經(jīng)成為一種重要的奶牛乳房炎診斷工具，不僅用于微生物的種、亞種、菌株水平鑒定，還用于流行病學(xué)研究。核糖分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)經(jīng)常被用于基因分型[23,24]。Pumipuntu等[25]使用PFGE和MLST進(jìn)行金黃色葡萄球菌引起牛乳房炎的各菌株基因分型鑒定，發(fā)現(xiàn)凝固酶陽(yáng)性分離株具有11 種不同的PFGE模式和一種不可分型模式，其中個(gè)別模式與多位點(diǎn)ST無(wú)關(guān)，在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的ST隔離。陳婷婷等[26]利用多位點(diǎn)序列分型(MLST)對(duì)甘肅部分地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)26株金黃色葡萄球菌中存在9種ST序列型，其中ST59為優(yōu)勢(shì)序列型。本方法具有方便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但因其成本昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)，現(xiàn)階段難以投入臨床使用。

3 奶牛乳房炎診斷在防治中應(yīng)用的思考

3.1 早期快速準(zhǔn)確診斷是做好防治工作的重要前提

奶牛乳房炎因素多，涉及病原廣，以分子生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)快速及實(shí)驗(yàn)室高通量快速準(zhǔn)確診斷技術(shù)將是未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)，如多病原基因芯片或蛋白芯片技術(shù)，基因組、蛋白質(zhì)組及代謝組學(xué)技術(shù)。此外，智能化、信息化技術(shù)結(jié)合也是診斷領(lǐng)域研發(fā)熱點(diǎn)，如生物傳感器技術(shù)有望成為檢測(cè)奶牛乳腺炎的重要工具。各方法優(yōu)缺點(diǎn)不同，單一應(yīng)用無(wú)法達(dá)到理想目標(biāo)。因此，多種方法聯(lián)合應(yīng)用可更準(zhǔn)確的防治，如以PCR檢測(cè)為主，體細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)相結(jié)合的應(yīng)用。

3.2 特征性生理指標(biāo)及代謝產(chǎn)物等檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)是做好防治工作的重要支撐

隱性乳房炎系診斷領(lǐng)域重要課題。及時(shí)監(jiān)測(cè)奶牛采食量及整體活動(dòng)方面的變化，如用IRT技術(shù)監(jiān)測(cè)奶牛乳房表面溫度，再通過(guò)檢測(cè)乳汁中一些酶活性物質(zhì)的活性或代謝產(chǎn)生的微量元素來(lái)客觀評(píng)估乳房炎的病程情況，為實(shí)施綜合治療方案提供支撐。

3.3 簡(jiǎn)便、快捷的適用技術(shù)廣泛推廣是臨床診斷的迫切要求

不同規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)采取相適應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，在大型規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中，奶牛數(shù)量多，若用常規(guī)檢測(cè)，則費(fèi)時(shí)費(fèi)力，貽誤病情。應(yīng)利用數(shù)字化、信息化、人工智能等相關(guān)技術(shù)使用傳感器數(shù)據(jù)來(lái)改善乳房炎管理的新方法。在小型養(yǎng)殖場(chǎng)中，飼養(yǎng)及相關(guān)獸醫(yī)技術(shù)人員層次不齊，開(kāi)發(fā)類似乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)、乳汁pH測(cè)定、乳清中蛋白含量測(cè)定以及現(xiàn)場(chǎng)熒光定量PCR、試紙條、LAMP等簡(jiǎn)便、適用技術(shù)，是進(jìn)行快速推廣和實(shí)現(xiàn)及時(shí)快速處置的有效手段。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第9篇

題目：綿羊短尾表型研究進(jìn)展

世界上脊椎動(dòng)物的尾巴大部分是天生的，尾巴被賦予了獨(dú)特的功能，如維持身體平衡、同一物種間的通訊工具和攻擊、儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)、體溫調(diào)節(jié)等[1]，研究人員發(fā)現(xiàn)一類動(dòng)物的尾部長(zhǎng)度明顯短于此范圍，這種現(xiàn)象可以穩(wěn)定地遺傳給后代，“短尾征”也以此現(xiàn)象命名[2]。在進(jìn)化過(guò)程中，犬、貓、鼠、猴等動(dòng)物也出現(xiàn)了尾巴缺失或縮短的情況。綿羊也不例外，國(guó)內(nèi)外研究者因此提出了綿羊“短尾征”的概念。目前，動(dòng)物短尾的成因已成為動(dòng)物遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一。然而，國(guó)際權(quán)威網(wǎng)站上關(guān)于“短尾征”的研究論文主要集中在犬、貓、小鼠的短尾形成方面，綿羊短尾機(jī)制的研究較少。

中國(guó)地方綿羊品種按尾型分為5種，即短肥尾羊、長(zhǎng)肥尾羊、短瘦尾羊、長(zhǎng)瘦尾羊、肥臀羊。根據(jù)歷史、考古和遺傳學(xué)證據(jù)，蒙古羊是中國(guó)短尾羊品種的共同祖先。隨著對(duì)健康、營(yíng)養(yǎng)和肥胖認(rèn)識(shí)的不斷提高,人們對(duì)肉類食品質(zhì)量的要求逐漸提高，脂肪含量已成為衡量肉類食品質(zhì)量的主要因素，脂肪的過(guò)度積累將嚴(yán)重影響動(dòng)物的健康和肉類食品的品質(zhì)和口感，因此高蛋白羊肉在畜牧產(chǎn)品市場(chǎng)越來(lái)越受消費(fèi)者的歡迎。因此，綜合考慮消費(fèi)者健康及牧民的養(yǎng)殖效益，養(yǎng)殖短尾羊已經(jīng)成為養(yǎng)殖業(yè)的新選擇。在眾多短尾綿羊品種中，呼倫貝爾短尾綿羊因其高蛋白質(zhì)含量、獨(dú)特的肉質(zhì)、高瘦肉率和遺傳穩(wěn)定而脫穎而出。呼倫貝爾羊有2個(gè)品種，即“短尾羊”和“大尾羊”。由于不同綿羊尾部性狀存在諸多差異，造成此差異的遺傳學(xué)機(jī)制還不明確，因此研究控制綿羊尾部表型的形成機(jī)制至關(guān)重要。論文在綿羊短尾性狀遺傳學(xué)機(jī)制研究上做一綜述，以期對(duì)了解和研究控制綿羊尾部大小的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 綿羊尾部及短尾表型形成機(jī)制研究

研究人員發(fā)現(xiàn)，綿羊短尾表型的形成主要是由于尾部脂肪沉積和尾椎骨畸形[3]。目前，蒙古羊是中國(guó)分布最廣、數(shù)量最多的綿羊品種。隨著貿(mào)易、民族間戰(zhàn)爭(zhēng)和草原部落向南移動(dòng)，除了內(nèi)蒙古自治區(qū)外，蒙古羊被傳入中國(guó)新疆、甘肅、青海、河南、山東、江蘇、浙江等省份，是我國(guó)寶貴的畜牧遺傳資源之一。目前，由于消費(fèi)者對(duì)肉類的低脂肪、高蛋白、高營(yíng)養(yǎng)等健康食品的要求，越來(lái)越多的牧民正在繁殖和擴(kuò)大綿羊中的短尾型綿羊的養(yǎng)殖。這使得綿羊短尾表型形成機(jī)制成為了眾多科研人員研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。對(duì)于尾部脂肪沉積與尾椎骨畸形兩方面的研究?jī)?nèi)容，不同的研究人員得出了不同的研究結(jié)論，但是，現(xiàn)階段大部分相關(guān)研究更多的聚焦于某一種引起短尾性狀的生物分子學(xué)機(jī)制，這可能與不同類短尾表型綿羊所在地域和人工繁育以及研究時(shí)所選參考基因組版本等諸多因素密切相關(guān)。現(xiàn)有研究顯示，雖然不同地區(qū)短尾綿羊在表型上有一定的差異，但絕大部分表型是脂尾短厚而寬，部分覆蓋或完全露出肛門、外陰。

1.1 影響短尾綿羊尾部脂肪沉積的因素探討

儲(chǔ)存在羊尾巴上的脂肪與儲(chǔ)存在駱駝駝峰上的脂肪起著相同的作用，幫助它們?cè)诃h(huán)境惡劣、食物資源匱乏的不利環(huán)境中生存。在食物充足的情況下，肥尾羊會(huì)在尾部?jī)?chǔ)存大量多余脂肪，形成一條又長(zhǎng)又大的肥尾巴。由于綿羊脂肪的積累需要攝取更多的能量，所以會(huì)降低綿羊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。發(fā)展和繁殖短尾型綿羊的目的是為了提高綿羊飼養(yǎng)過(guò)程中的肉類比例，滿足消費(fèi)者對(duì)健康食品的需求。早期的研究表明，影響綿羊尾巴沉積的基因不會(huì)影響綿羊的整體脂肪水平，而只影響身體某些部位的脂肪沉積[4]。一些研究人員直接以綿羊的尾巴為研究對(duì)象，篩選和鑒定與尾巴脂肪積累相關(guān)的基因。

1.1.1 基因 文獻(xiàn)[4]選擇湖羊(短肥尾)和藏羊(短瘦尾)作為研究對(duì)象，該研究指出，綿羊尾巴中的脂肪沉積和綿羊尾巴長(zhǎng)度的類型可能與BMP2蛋白有關(guān)。另外，Bmp2基因直接參與了綿羊胚胎時(shí)期的形態(tài)和體節(jié)的發(fā)育[5]。Bmp2基因與非洲爪蟾尾巴的再生和發(fā)育有關(guān)，這一點(diǎn)在非洲爪蟾的研究中也得到了證實(shí)，并且Bmp2基因作為轉(zhuǎn)錄抑制劑直接受Vrtn基因調(diào)控。Vrtn基因也是控制綿羊和豬脊椎動(dòng)物數(shù)量的主要候選基因。綜合來(lái)看，Bmp2基因可能在動(dòng)物骨骼發(fā)育過(guò)程中起作用。與大尾羊相比，短尾羊的尾骨數(shù)量與脂肪量明顯較少，但Bmp2促進(jìn)脂肪的形成和成骨細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)綿羊尾骨數(shù)量或直接參與綿羊尾巴脂肪的積累，影響脂肪積累量[6]。該項(xiàng)研究推測(cè)得出尾椎體數(shù)量的增加與脂肪沉積量的增加有密切的關(guān)系。

1.1.2 蛋白 在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方面，有研究成果表明FABP4蛋白在尾部沉積中起著重要作用[7]，PPAR信號(hào)通路中的差異表達(dá)蛋白可能調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的代謝和分化。參與PPAR信號(hào)通路的差異表達(dá)蛋白可能發(fā)揮了對(duì)綿羊尾臀部脂肪細(xì)胞的分化與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用，特別是肥尾型綿羊的FABP4蛋白的高表達(dá)。Han J等的研究篩選得到了大尾羊中有幾種與脂肪沉積和脂肪形成相關(guān)的功能候選基因包括acsl1、acaca、acly、fasn、atgl和hsl，這些基因已被驗(yàn)證為決定脂肪組織脂質(zhì)代謝的重要因素[7]。同時(shí)，該項(xiàng)研究檢測(cè)到acsl1、acaca、acly和fasn這4種基因分別在大尾綿羊尾部中上調(diào)，這些上調(diào)的蛋白質(zhì)可能在調(diào)節(jié)脂肪酸的運(yùn)輸、合成和脂肪組織的形成方面起重要作用[8，9]。脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的質(zhì)量增加和脂肪的積累，都是產(chǎn)生脂肪的主要原因[10]。PPAR信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞增殖起著重要作用[11]，PPAR信號(hào)通路中的基因(包括Fabp4、Fabp5、Acaa1、Acsl1、Lpl、Acsl6、Plin4、Plin1、Scd和Adipoq)在大尾羊尾部基因表達(dá)明顯上調(diào)。PPAR信號(hào)通路中這些上調(diào)的基因可能有助于綿羊尾部或臀部的脂肪沉積[12]。

在Ren X[13]等使用了SNP基因分型技術(shù)的研究中，發(fā)現(xiàn)4個(gè)候選基因(Rip140、Ctbp1、Steap4和Creb1)可能與綿羊尾部脂肪沉積相關(guān)。Hongying Fan[14]等人以呼倫貝爾短尾羊與巴爾虎羊(大尾羊)為研究對(duì)象，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)Hadnb、Echs1、Acsl5、Hadh和Ppt1這5個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，Cpt1b和Gcdh2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，通過(guò)對(duì)短尾母羊與大尾母羊的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)大尾羊尾巴中有7個(gè)基因(Fads1、Fads2、Acsl1、Elovl5、Plin1、Ehhadh和Acald)上調(diào)，這解釋了呼倫貝爾短尾羊和巴爾虎羊尾脂肪相關(guān)基因的差異表達(dá)。

Zhang等[15]對(duì)細(xì)尾羊和肥尾羊品種的研究中，染色體5、7和X被確定為影響脂肪沉積的3個(gè)基因組區(qū)域。Moioli等[16]對(duì)2個(gè)肥尾品種和13個(gè)細(xì)尾品種數(shù)量的標(biāo)記基因全譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因Bmp2和Vrtn可能與羊尾型有關(guān)。Yuan等[17]在肥尾和細(xì)尾羊中檢測(cè)到標(biāo)記基因Bmp2、Hoxa11、Wdr92、Ppp1cc、Sp3、Sp9和Prokr1對(duì)肥尾羊和細(xì)尾羊的尾部脂肪發(fā)育有積極影響，并可通過(guò)相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)脂肪分解。對(duì)蒙古綿羊尾部脂肪沉積的研究表明，發(fā)育基因Hoxc13、Hoxc12、Hoxc11和脂肪尾部表達(dá)基因Sp9、Hotair3、Hotair2以及脂肪相關(guān)基因Adipoq、Cd36、Fabp4、Fabp5都是形成脂肪沉積的重要基因[18]。

1.1.3 微小核糖核酸miRNA 微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一種非編碼的單鏈RNA分子，由內(nèi)源性基因編碼，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。它是由Dicer和Drosha核糖核酸酶Ⅲ蛋白質(zhì)處理的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。miRNA在脂肪細(xì)胞分化和維持生物穩(wěn)態(tài)中起著決定性作用。Mohammad[19]等以Lori-Bakhtiari羊(寬肥尾)和Zel羊(瘦脂尾)為研究對(duì)象，最終篩選出7個(gè)不同表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)重要的生物過(guò)程模塊與胰島素分泌、脂質(zhì)代謝有關(guān)。近年來(lái)，關(guān)于miRNA在生物體內(nèi)家畜脂肪組織中的作用的研究越來(lái)越多，但關(guān)于綿羊miRNA的脂質(zhì)控制代謝的報(bào)道很少。徐紅偉[20]等發(fā)現(xiàn)，從形態(tài)學(xué)和組織學(xué)的角度，以小尾寒羊和蘭州大尾寒羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)尾脂進(jìn)行組學(xué)分析，篩選出不同表達(dá)的蛋白質(zhì)、基因和非編碼RNA(ncRNA)等調(diào)控因子，這對(duì)了解不同肥尾類型綿羊體脂分布的機(jī)理具有重要作用;在小尾寒羊和蘭州大尾巴羊的尾部脂肪組織中，共發(fā)現(xiàn)了11種miRNA表達(dá)的差異性，其中6種miRNA在不同的脂肪組織中表現(xiàn)的差異特別明顯。顯然，僅通過(guò)基因表達(dá)譜分析很難準(zhǔn)確地找到脂肪沉積的特定調(diào)控途徑。有必要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，以揭示羊尾脂肪沉積的確切遺傳機(jī)制。

1.1.4 性別因素 性別差異引起二者在新陳代謝上表現(xiàn)出極為顯著的差異，過(guò)往研究分析了大量性別差異下的生理學(xué)異同，比如，差異化性別間的激素水平與基因表達(dá)的不同之處，研究結(jié)果顯示，相對(duì)于男性腹部，女性臀部與大腿部分的脂肪沉積更明顯。這說(shuō)明，某些特定部分的脂肪沉積受到獨(dú)特基因的控制。所以，在特定部位與不同性別間脂肪沉積的遺傳機(jī)制是存在差異的。Hongying Fan[21]對(duì)比研究了呼倫貝爾短尾羊和大尾羊2類呼倫貝爾羊的尾部轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，其創(chuàng)新之處體現(xiàn)在將性別影響因素考慮進(jìn)來(lái)展開(kāi)研究，在尾部大小一致的兩種性別間對(duì)比，結(jié)果顯示，大尾羊和小尾羊分別有獨(dú)立的9個(gè)和12個(gè)生物學(xué)過(guò)程。首先，在尾部大小不一樣的雄性綿羊群中，在13條KEGG信號(hào)通路內(nèi)富集差異基因。在其中確定了與脂肪酸代謝存在相關(guān)性的脂肪酸降解、脂肪酸代謝和延伸率三個(gè)生物學(xué)過(guò)程。在尾部大小不一樣的雌性綿羊群中所獲得的差異基因，合計(jì)富集到51條KEGG信號(hào)通路，而與脂肪沉積存在相關(guān)性的信號(hào)通路有兩條，參與了脂肪酸代謝和脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)降解的調(diào)控過(guò)程。然而，在短尾羊樣本內(nèi)與脂肪代謝相關(guān)的信號(hào)通路僅有PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑這一條。在對(duì)比大尾羊和短尾公羊的差異基因富集的信號(hào)通路時(shí)發(fā)現(xiàn)了與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)相關(guān)的信號(hào)通路。此項(xiàng)研究確定了7個(gè)基因影響PPARG及大量其他調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而對(duì)雄性呼倫貝爾綿羊尾脂肪中與脂肪酸代謝存在相關(guān)性的基因表達(dá)變化進(jìn)行了解釋，其中PPT1、HADH、ECHS1、HADHB和ACSL5這5個(gè)基因被上調(diào)，而CPT1B和GCDH基因則被下調(diào)。通過(guò)對(duì)比分析大尾與短尾母羊的相關(guān)數(shù)據(jù)可知，前者尾部的FADS1、ACADL、FADS2、PLIN1、ELOVL5、ACSL1和EHHADH基因表達(dá)都有上調(diào)，這7個(gè)基因可能影響綿羊胰島素的分泌，并且也能夠?qū)Π蜖柣⒀蚺c呼倫貝爾短尾羊尾脂肪中與脂肪酸代謝存在相關(guān)性的基因的差異表達(dá)進(jìn)行了解釋。

1.2 影響短尾綿羊尾椎骨發(fā)育的因素探討

1.2.1Brachyury基因Brachyury基因(T基因)編碼屬于T-box轉(zhuǎn)錄因子家族的BRACHYURY蛋白。BRACHYURY蛋白的轉(zhuǎn)錄活性在中胚層的形成和分化中起著關(guān)鍵作用[22]。Brachyury/T基因首先在原腸期表達(dá)，隨后的表達(dá)逐漸局限于發(fā)育中的尾芽和脊索，Brachyury/T基因的缺失或不正確表達(dá)將導(dǎo)致狗、貓、小鼠和綿羊的正常胚胎發(fā)育異常[23]。Brachyury/T基因在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中可調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和Wnt信號(hào)通路，Brachyury/T基因在突變雜合子個(gè)體中顯示骨缺損，在突變純合子個(gè)體中顯示嚴(yán)重的發(fā)育障礙，最終導(dǎo)致發(fā)育停止和死亡[24]。在對(duì)伊朗Dalagh短尾羊和Mehraban羊的研究中，提到純合Brachyury/T突變僅表明這些羊的尾部脊椎發(fā)育受到抑制[25]，這表明Brachyury/T突變可能促進(jìn)大尾羊尾部脂肪的積累。

在J Han[26]等的研究中，特別強(qiáng)調(diào)羊尾巴表型與Brachyury/T基因的c.333G與c.G334T 的2個(gè)突變有關(guān)。對(duì)于Brachyury/T中的這2個(gè)突變位點(diǎn)，純合基因型為CT/CT，僅存在于短尾綿羊中，但在大尾綿羊中未發(fā)現(xiàn)該基因型。Pfam結(jié)構(gòu)域分析表明，333和334個(gè)核苷酸分別對(duì)應(yīng)于111和112個(gè)氨基酸殘基，短臂蛋白的T盒結(jié)構(gòu)域可以激活基因轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步的雜交試驗(yàn)表明，短尾羊和大尾羊后代Brachyury/T基因的333與334為雜合GG/CT突變，均為長(zhǎng)尾或正常表型。結(jié)果表明，GG單倍型為單顯性基因遺傳，CT/CT可能為“短尾”表型的隱性基因型。僅通過(guò)對(duì)Brachyury/T基因表達(dá)的分析，很難了解尾椎體畸形的具體調(diào)控途徑。有必要在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究，以揭示綿羊尾部脂肪沉積的確切遺傳機(jī)制。

1.2.2 其他基因 MGI數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)記載了與短尾表型存在相關(guān)性的多種基因。對(duì)于小鼠身上導(dǎo)致短或異常尾巴的一系列不同基因可被視為是綿陽(yáng)等其他短尾動(dòng)物的候選基因。在關(guān)于鼠的研究中，從遺傳學(xué)維度分析了軸向骨骼發(fā)育，研究結(jié)果顯示，大量不同類基因與突變參與了尾椎骨的發(fā)育，并影響到機(jī)體的生殖力、體細(xì)胞與減數(shù)分裂，進(jìn)而清晰地揭示了脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程[27]。

Pax1基因(成對(duì)框基因1)主要參與了骨骼發(fā)育和轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。在脊柱動(dòng)物胚胎階段脊柱發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[28]。Pax1在小鼠中3個(gè)等位基因突變導(dǎo)致出現(xiàn)短尾或無(wú)尾現(xiàn)象，Pax1基因參與生骨節(jié)凝聚過(guò)程，且腰骶椎周圍并未發(fā)生內(nèi)側(cè)生骨節(jié)的凝聚過(guò)程，因?yàn)椴荒苷o(wú)成此地程，使椎體與椎間盤無(wú)法正常生成[29]。

Wnt3a基因是Wnt家族中的一個(gè)成員，其對(duì)胚胎期神經(jīng)后軸的增殖與體節(jié)發(fā)育都不可或缺[30]。去除此基因的小鼠，由于尾芽不能正常發(fā)育使得其身形變短，純合突變的小鼠尾部大幅變形，表現(xiàn)出短尾、絲狀尾和無(wú)尾等現(xiàn)象，尾椎骨不完整，椎體外形不正常。一些小鼠甚至缺少骶骨前椎體，并在這些部位可觀察到畸形的尾部神經(jīng)管。

再者，還有HES7基因[31]、Bmper[32]、Dvl2[33]和T基因[34]等。但是，考慮到動(dòng)物的尾部形態(tài)類型多樣，只是研究鼠這一種動(dòng)物，是不可能下結(jié)論解釋其他哺乳動(dòng)物尾巴的多樣性。所以，需要進(jìn)一步研究非模型物種，深入全面地研究綿羊等非鼠類哺乳動(dòng)物尾巴的多樣性機(jī)制。

2 展望

綿羊尾部脂肪堆積過(guò)多，尾部過(guò)大，無(wú)法滿足目前人們對(duì)優(yōu)質(zhì)肉類的需求。綿羊尾巴脂肪積累和綿羊尾骨發(fā)育畸形的遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)綿羊新品種的選擇具有重要意義。論文從影響短尾綿羊尾部脂肪沉積的因素、影響短尾綿羊尾椎骨發(fā)育的因素深入探討綿羊短尾表型形成機(jī)制，綜述了基因、蛋白、miRNA和性別對(duì)綿羊尾部脂肪沉積的影響以及Brachyury基因和其他基因?qū)Χ涛簿d羊尾椎骨發(fā)育的影響。通過(guò)總結(jié)國(guó)內(nèi)外綿羊短尾表型形成機(jī)制的研究現(xiàn)狀，關(guān)于綿羊短尾表型形成機(jī)制未來(lái)優(yōu)化研究提出若干展望。后續(xù)研究中可精準(zhǔn)篩選與綿羊尾部脂肪堆積和尾椎骨畸形過(guò)程相關(guān)的基因，探索綿羊尾部表型的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)分析綿羊尾部表型的形成具有重要價(jià)值，培育短尾和低脂肉用綿羊具有重要的意義。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第10篇

題目：鴨疫里默氏菌毒力相關(guān)因子研究進(jìn)展

鴨疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)可感染雛鴨、雛火雞、鵝等多種禽類，引發(fā)高致病性、接觸性傳染病。本病最早于1932年發(fā)現(xiàn)于美國(guó)紐約州的長(zhǎng)島，其后在英國(guó)、加拿大、前蘇聯(lián)、澳大利亞等國(guó)亦有發(fā)生。我國(guó)于1982年首次報(bào)道有該病的存在。鴨疫里默氏菌病也稱鴨傳染性漿膜炎(Infectious serocitis，IS)，該病主要感染1周齡～8周齡，尤其是2周齡～3周齡的雛鴨，引起多發(fā)性、滲出性炎癥和全身性敗血癥。病變主要以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。鴨疫里默氏菌病發(fā)病率可達(dá)90%以上，病死率高達(dá)75%。目前，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

鴨疫里默氏菌為革蘭氏陰性菌，其菌體細(xì)胞壁表面多糖抗原具有多樣性使得該菌的血清型呈多態(tài)化。目前確定的鴨疫里默氏菌有20多種血清型，且不同地區(qū)流行的血清型存在較大差異。血清1型、2型、10型菌株是近年來(lái)國(guó)內(nèi)的優(yōu)勢(shì)流行菌株。不同血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)性，生產(chǎn)中多見(jiàn)多種血清型混合感染且新血清型不斷出現(xiàn)的情況，給該病的防控造成很大困難。

病原菌致病是細(xì)菌與宿主復(fù)雜相互作用的結(jié)果。一方面細(xì)菌通過(guò)表達(dá)、分泌多種毒力因子入侵宿主、逃避宿主免疫系統(tǒng)的捕殺并完成在宿主內(nèi)的繁殖，另一方面宿主通過(guò)其防御系統(tǒng)抵抗這些毒力因子的作用。為有效防治鴨疫里默氏菌病，需要深入研究該菌感染的分子機(jī)制和毒力因子。近年來(lái)，隨著研究的深入，越來(lái)越多的RA毒力相關(guān)因子被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道[1]。

1 細(xì)菌外膜相關(guān)組分

1.1 外膜蛋白

外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，位于病原菌表面，也是最先與宿主細(xì)胞相互作用的部位，在維持菌體自身結(jié)構(gòu)及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、致病等方面發(fā)揮著重要作用。OMPs還具有較強(qiáng)的免疫原性且能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[2]。非菌毛黏附素——外膜蛋白A(OmpA)是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，存在于大多數(shù)革蘭氏陰性菌的外膜中。OmpA蛋白是鴨疫里默氏菌中最早被鑒定的、具有免疫原性的主要外膜蛋白[2]。研究發(fā)現(xiàn)，RA野生株Th4的OmpA基因缺失株Th4ΔompA對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力顯著低于野生株，且Th4ΔompA對(duì)10日齡櫻桃谷鴨的致死力較野生株下降了10倍以上[3]。表明OmpA是RA的一個(gè)重要毒力因子。

1.2 表面多糖

1.2.1 脂多糖生物合成相關(guān)因子 細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌胞壁特有的組分。在感染過(guò)程中，LPS可激活炎性細(xì)胞釋放多種炎癥因子，導(dǎo)致多種生理和病理?yè)p傷。LPS由3種不同的成分組成，即脂質(zhì)A、O抗原和核心寡糖。研究發(fā)現(xiàn)，RA Yb2株AS87-04050基因編碼LPS。通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入誘變技術(shù)使AS87-04050基因失活，銀染鑒定突變株RA2640的LPS形態(tài)與野生株不同，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上由光滑型變?yōu)榇植谛?RA2640較野生株對(duì)抗生素、消毒劑和正常鴨血清的敏感性更高，且RA2640的毒力降低了10萬(wàn)倍以上。表明RA AS87-04050基因與RA LPS的生物合成有關(guān)，并影響RA的致病性和毒力[4]。

研究者通過(guò)構(gòu)建RA Tn4351轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)，分別篩選到RA CH3菌株M949-1360、M949-RS01035、M949-RS01915基因的缺失突變株RAΔ604、RA1062、RA1067。突變株RAΔ604不能產(chǎn)生LPS，對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力較野生株下降，且對(duì)鴨的半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)比野生株高了200倍[5]。突變株RA1062與抗CH3 LPS單克隆抗體作用無(wú)反應(yīng)，LPS表型較CH3野生株粗糙，且對(duì)補(bǔ)體依賴性殺傷的敏感性更高，血液細(xì)菌載量降低，毒力減弱[6]。M949-RS01915基因參與RA LPS O抗原的合成，其基因缺失突變株RA1067的LPS與野生株相比存在缺陷;RA1067生長(zhǎng)較野生株慢，對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)更加敏感，對(duì)Vero細(xì)胞的黏附和侵襲能力均下降，感染鴨血液中菌量也明顯降低，毒力下降了360多倍[7]。以上結(jié)果表明RA CH3菌株的M949-RS01915、M949-1360、M949-RS01035基因也與RA LPS的生物合成和RA的毒力有關(guān)。

1.2.2 莢膜多糖生物合成相關(guān)因子 莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是位于細(xì)菌最外面的一層厚度不定的黏液物質(zhì)，主要由酸性多糖組成。CPS直接與細(xì)菌所處的環(huán)境接觸，可保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受宿主免疫機(jī)制的影響，包括抗吞噬和抗溶菌活性、免疫逃避和免疫調(diào)節(jié)，且CPS還具有免疫原性。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli) Wza是一種保守的外膜脂蛋白，參與1族CPS通過(guò)外膜的輸出，而Wzc是一種內(nèi)膜酪氨酸自激酶。Wza-Wzc復(fù)合物可以跨越周質(zhì)，連接內(nèi)外膜，提供1族CPS輸出途徑，調(diào)節(jié)1族CPS的合成和輸出。研究發(fā)現(xiàn),RAwza缺失突變株未能產(chǎn)生CPS，缺失株具有更強(qiáng)的疏水性，更易自聚集，形成更多生物膜，毒性比野生型要低[8]。還發(fā)現(xiàn)RAwza和wzc雙基因缺失影響了莢膜的生成、輸出和細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致表面疏水性、自凝集能力、生物膜形成能力增強(qiáng)，降低了RA的致病性[8]。以上結(jié)果表明，wzc與wza均參與CPS的合成與輸出，并影響RA的毒力。

2 細(xì)菌獲鐵系統(tǒng)相關(guān)因子

鐵是大多數(shù)細(xì)菌的基本元素，鐵離子是病原菌重要的生長(zhǎng)因子。細(xì)菌的獲鐵系統(tǒng)在其感染宿主及致病過(guò)程起著重要作用。細(xì)菌獲鐵系統(tǒng)的蛋白同時(shí)也是重要的毒力因子。

2.1 TonB蛋白

TonB蛋白是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的一種蛋白，參與鐵等物質(zhì)的運(yùn)輸。革蘭氏陰性菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中需要從外界攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。一些小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以自由地通過(guò)革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜，而一些大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)需要特異性的TonB復(fù)合物依賴性外膜受體進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。TonB復(fù)合物由TonB、ExbB、ExbD構(gòu)成，ExbB和ExbD蛋白質(zhì)將TonB錨定在細(xì)胞質(zhì)膜中，而作為能量傳遞蛋白的TonB作為二聚體跨越周質(zhì)空間，與高豐度的外膜受體相互作用。TonB蛋白已被證明對(duì)許多細(xì)菌病原體的毒性至關(guān)重要。

RA預(yù)計(jì)包含2個(gè)TonB-ExbB-ExbD系統(tǒng)[9]，即ExbB1-ExbD1-TonB1和ExbB2-ExbD2-ExbD29-TonB2。研究發(fā)現(xiàn)，RA CH3 株TonB1、TonB2基因缺失株CH3△tonB1、CH3△tonB2對(duì)Vero細(xì)胞的黏附和侵襲較親本株顯著降低，在雛鴨體內(nèi)的LD50分別比CH3野生株高224倍和87倍，感染后雛鴨血液細(xì)菌載量均較CH3親本株顯著降低[9]，表明TonB1和TonB2蛋白都影響RA的毒力。在L-半胱氨酸存在下，RA CH3可以利用血紅素作為唯一的鐵源，但CH3△tonB1出現(xiàn)血紅素鐵獲取缺陷;進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建雙突變體系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)tonB1和tonB2都被突變時(shí)，RA CH1株血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)才被完全取消[9]，表明TonB1和TonB2蛋白還通過(guò)參與血紅素在RA中的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響細(xì)菌獲鐵功能和毒力。

2.2 TonB依賴受體TbdR1

TonB依賴受體TbdR1是TonB系統(tǒng)中的一種外膜受體， TbdR1通過(guò)與TonB復(fù)合物相互作用，參與血紅素鐵的獲取[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在低鐵環(huán)境下，RA CH3株tbdR1基因缺失株CH3△tbdR1比野生株和回補(bǔ)株生長(zhǎng)速度慢，生物被膜形成能力較野生株顯著降低，毒力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生株[10]，表明 TbdR1 是鴨疫里默氏菌的一種毒力因子。

2.3 鐵載體相互作用蛋白

鐵載體相互作用蛋白(siderophore-interacting protein，sip)參與調(diào)控鐵載體基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，在鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，RA CH3 株sip基因缺失突變株CH3△sip在限鐵的條件下生長(zhǎng)增殖緩慢且生物膜形成減少，對(duì)Vero細(xì)胞的黏附和入侵能力降低，對(duì)小鴨的LD50是親本株的 35 倍[11]。還發(fā)現(xiàn)23/24(95.83%)RA強(qiáng)毒株具有sip基因[11]。以上結(jié)果表明，sip基因參與了RA的鐵吸收且與RA的毒力相關(guān)。

除TonB、TbdR1和SIP外，據(jù)報(bào)道，RA血清1型菌株CH-1的B739-1343(編碼 TonB 依賴性的轉(zhuǎn)鐵蛋白)，B739-1208(血晶素受體基因)基因編碼蛋白與鐵的攝取有關(guān)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，CH-1株B739-1343基因缺失株CH-1ΔB739-1343在缺鐵環(huán)境下較親本株生長(zhǎng)受到明顯抑制，且對(duì)鴨的致病力明顯降低[12]。CH-1 株的B739-1208基因缺失株CH-1ΔB739-1208也喪失了對(duì)鐵的攝取能力，生長(zhǎng)能力和毒力較親本株顯著下降，感染后鴨血液、肝臟、腦組織的菌載量都顯著降低[13]。以上結(jié)果表明B739-1343、B739-1208基因與RA的毒力相關(guān)。

3 細(xì)菌分泌系統(tǒng)相關(guān)因子

致病菌毒力因子的釋放有賴于專屬的分泌系統(tǒng)，許多革蘭氏陰性細(xì)菌通過(guò)分泌系統(tǒng)將毒力因子從細(xì)菌的胞內(nèi)分泌到宿主細(xì)胞或者環(huán)境中。已發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌分泌系統(tǒng)有9個(gè)(Ⅰ型到Ⅸ型)。sprT、sprA基因是Ⅸ型分泌系統(tǒng)(T9SS)組成元件，研究發(fā)現(xiàn)，RA基因缺失株ΔsprT和ΔsprA對(duì)10日齡雛鴨的毒力均較親本株顯著下降，血液和脾臟組織中菌載量較親本株低，且對(duì)鴨血清殺菌活性的敏感性較親本株高[14]。通過(guò)構(gòu)建RA Yb2菌株Tn4351轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)，篩選到與滑行運(yùn)動(dòng)及Ⅸ型分泌系統(tǒng)相關(guān)的gldG、gldK、gldM、gldL、gldN基因缺失株[15-20]。毒力測(cè)定結(jié)果顯示，缺失株Yb2ΔgldG、Yb2ΔgldK、Yb2ΔgldM、Yb2ΔgldL、Yb2△gldN、Yb2ΔgldL-gldN毒力較Yb2親本株分別下降了2 953倍、7 009倍、184倍、48倍、54倍、110倍[15-20]。缺失株Yb2ΔgldK、Yb2 ΔgldM、Yb2ΔgldL、Yb2△gldN、Yb2ΔgldL-gldN感染鴨組織中的細(xì)菌量均較親本株顯著降低[17-19]，缺失株Yb2ΔgldK、Yb2 ΔgldM在滑行運(yùn)動(dòng)和蛋白質(zhì)分泌方面存在缺陷[16-17]。對(duì)RA CH-1 的gldK基因缺失株進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)，CH-1ΔgldK感染后鴨血液、肝臟、腦組織的菌載量明顯低于野生株，對(duì)鴨的LD50約為野生株的1.5×103倍，且對(duì)鴨的致死率顯著低于野生株[20]。以上結(jié)果表明sprT、sprA、gldG、gldK、gldM、gldL、gldN基因與RAⅨ型分泌系統(tǒng)相關(guān)，Ⅸ型分泌系統(tǒng)與RA的毒力有關(guān)。

4 細(xì)菌調(diào)控相關(guān)因子

鐵攝取調(diào)節(jié)(ferric uptake regulator，F(xiàn)ur) 蛋白可調(diào)控細(xì)菌對(duì)鐵的攝取和利用，同時(shí)對(duì)廣泛細(xì)胞過(guò)程(氧化還原脅迫反應(yīng)、毒素與毒力因子)具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，RA Fur缺失突變株感染產(chǎn)生的病理?yè)p傷較野生株輕，且毒力降低[21]，提示Fur蛋白與RA的毒力相關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RAYM-RS09735和RAYM-RS09740是1對(duì)PhoP/PhoR雙組份調(diào)控系統(tǒng)。RAYM-RS09735/RAYM-RS09740雙基因缺失突變株的LD50> 1011CFU，且缺失株在心臟、大腦、肝臟、血液和脾臟中的菌載量顯著低于野生型，感染雛鴨后毒力顯著降低[22]，表明該雙組份調(diào)控系統(tǒng)與菌株的毒力有關(guān)。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(ArsR)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶(SthK)位于同一操縱子上。通過(guò)構(gòu)建ArsR/SthK雙基因缺失突變株，發(fā)現(xiàn)該缺失突變株對(duì)鴨的毒力下降[23]，提示ArsR/SthK雙組份與RA的毒力有關(guān)。

5 其他

LuxE基因編碼酰基蛋白合成酶(luxE)，該酶激活脂肪酸，形成脂肪酰AMP介導(dǎo)物，并作為生物發(fā)光脂肪酸還原系統(tǒng)的第二步發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，luxE基因缺失株Yb2ΔAS87-03730在TSB中的生長(zhǎng)速度和對(duì)Vero細(xì)胞的侵襲能力均較親本株顯著降低，LD50約為親本株的80倍，提示AS87-03730與RA的毒力相關(guān)[24]。

煙酰胺酶A(PncA)是催化煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酸的關(guān)鍵酶，是NAD挽救途徑中的一個(gè)重要反應(yīng)，影響病原體在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和傳播。通過(guò)轉(zhuǎn)座子技術(shù)獲得pncA(AS87 U 01735基因編碼)基因缺失株Yb2ΔpncA，與野生株Yb2相比，缺失株Yb2ΔpncA感染鴨血液中的細(xì)菌含量較低，心臟、肝臟和脾臟沒(méi)有明顯的組織學(xué)變化，對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力下降，對(duì)鴨的毒力下降了488 000倍[25]。表明AS87-03730與RA的毒力相關(guān)。

RIA-1614基因(RanB)是RA菌ABC的外排泵組分。研究發(fā)現(xiàn)，RA-GD菌株的RIA-1614基因缺失株RA-GD△RIA-1614的LD50值是親本株的43倍，感染雛鴨后的血液細(xì)菌載量比親本株降低了38倍，提示RIA-1614蛋白參與了菌株的毒力[26]。

除去以上概述的各種毒力相關(guān)因子，已報(bào)道的RA毒力相關(guān)因子還有CH3株M949-RS00050基因[27]、Yb2株AS87-RS09170(bioF)基因[28]、CH-1株B739-0373基因[29],CH-1株dps基因[30]等。

6 小結(jié)

鴨疫里默氏菌作為重要的水禽細(xì)菌病病原之一，一直受到研究者的高度關(guān)注。該菌引發(fā)的疫情多發(fā)生于鴨群，但近幾年鵝群暴發(fā)該病的報(bào)道逐漸增多。雖然商品化的RA疫苗已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水禽養(yǎng)殖，但生產(chǎn)中該病仍較多發(fā)生。且由于抗菌藥物的不規(guī)范使用導(dǎo)致耐藥菌株持續(xù)增加，使得RA在水禽養(yǎng)殖中的感染更為普遍和嚴(yán)重。

近年來(lái)，越來(lái)越多的鴨疫里默氏菌毒力相關(guān)因子被發(fā)現(xiàn)和研究，基于毒力因子的基因缺失疫苗研究也在不斷探索。由于RA的毒力因子多種多樣，不同毒力因子在致病過(guò)程中發(fā)揮的作用也不同。目前很難確定哪種毒力因子在致病過(guò)程中占主要地位，且毒力因子在細(xì)菌致病過(guò)程中的協(xié)同作用也需進(jìn)一步明晰。鑒于細(xì)菌毒力系統(tǒng)的復(fù)雜性，未來(lái)仍有很多問(wèn)題需要解決。因此，需要進(jìn)一步探究已知毒力因子的功能，探索已知毒力因子在致病過(guò)程中的協(xié)同作用，以及鑒定新的毒力相關(guān)因子，為闡明RA的致病機(jī)制、防治措施提供依據(jù)，同時(shí)也為新型藥物和疫苗的研發(fā)提供新的思路。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第11篇

題目：豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP4研究進(jìn)展

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的一種高度接觸性傳染病。PRRS俗稱豬藍(lán)耳病，由于PRRSV入侵會(huì)降低生豬免疫力，常伴隨混合感染而使疾病很難得到有效防控。1987年該病首次在美國(guó)報(bào)道，1990年荷蘭成功分離PRRSV并命名Lelystad virus(LV)株，1991年在美洲分離出VR2332株，2種PRRSV基因組序列差異較大并分別命名為歐洲株基因Ⅰ型和美洲株基因Ⅱ型。1996年中國(guó)首次成功分離到PRRSV[1]，命名為CH-1a。劉光清[2]等對(duì)PRRSV CH-1a株ORF1進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明ORF1全長(zhǎng)11882 bp，與LV株同源性較低，與VR2332株同源性較高。2006年中國(guó)暴發(fā)以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)為主要病原的“高熱癥”[3]，HP-PRRSV成為中國(guó)具有更高致病力流行株，2015年以后NADC-30 like毒株為流行毒株[4]，給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成更嚴(yán)重?fù)p失。目前一直沒(méi)有針對(duì)該病毒的有效藥物，疫苗的效果也有限，不斷重組與變異的PRRSV使得PRRS防控形勢(shì)更加嚴(yán)峻。

PRRSV是一種不分節(jié)段、有囊膜單股正鏈RNA病毒，核衣殼外圍包被脂質(zhì)雙層膜，對(duì)一些脂類溶劑如乙醚、氯仿敏感，這些物質(zhì)會(huì)溶解脂質(zhì)雙層膜而使病毒失活。PRRSV 基因組包括10個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading fame，ORF)。ORF1a和ORF1b占據(jù)整個(gè)PRRSV基因組3/4，翻譯形成2個(gè)多聚蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab可被NSP4水解成13個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，即NSP lα、NSP lβ及NSP2～NSP12，PRRSV基因組編碼8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5、GP5a、M、N。

NSP4具有3C樣絲氨酸蛋白酶(3CLSP)活性，最適溫度為8℃，最適pH為7.5，該酶能夠適應(yīng)高濃度Na+環(huán)境，對(duì)二價(jià)金屬離子(Zn2+、Cu2+)具有較高敏感性且蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)能抑制NSP4 3CLSP活性。NSP4可通過(guò)鉸鏈區(qū)(hinge region)信號(hào)作用主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞核，因此細(xì)胞核存在大量NSP4而細(xì)胞漿少量存在，鉸鏈區(qū)145-168位氨基酸可影響NSP4核定位。很多病毒與宿主相互作用過(guò)程中通過(guò)抑制IFN逃避宿主免疫反應(yīng)，其中PRRSV NSP4能抑制IFN-I產(chǎn)生，且該抑制作用與3CLSP 活性密切相關(guān)。PRRSV 3CLSP晶體結(jié)構(gòu)由3部分組成，2個(gè)反向平行β折疊桶(結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ)和1個(gè)C末端α/β結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Ⅲ)。NSP4 3CLSP活性區(qū)域位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ之間，第39位組氨酸(His)、第64位天冬氨酸(Asp)和第118位絲氨酸(Ser)構(gòu)成His-Asp-Ser 催化三聯(lián)體，是NSP4發(fā)揮3CLSP活性重要氨基酸位點(diǎn)，這3個(gè)氨基酸突變會(huì)使3CLSP喪失蛋白酶活性[5]。NSP4 3CLSP參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，可以作為一種重要靶蛋白揭示PRRSV復(fù)制機(jī)理。NSP4在PRRSV復(fù)制早期出現(xiàn)，PRRSV感染早期可在宿主體內(nèi)檢測(cè)到NSP4抗體[6]。對(duì)NSP4功能進(jìn)一步解析，將有助于探索PRRSV免疫逃逸與持續(xù)感染，為防控PRRS提供理論基礎(chǔ)。作者對(duì)NSP4遺傳變異、對(duì)病毒復(fù)制影響、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)宿主免疫、調(diào)控抗病毒反應(yīng)、與宿主相互作用、在PRRSV檢測(cè)方面進(jìn)行綜述，為疫苗設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)藥物提供理論參考。

1 NSP4遺傳變異分析

NSP4基因高度保守，董建國(guó)[7]通過(guò)對(duì)HP-PRRSV HuN4株與PRRSV CH-1a株NSP4氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)高致病性HuN4株和CH-1a株NSP4 氨基酸(aa)相似性高達(dá)96.5%，僅在7個(gè)aa位點(diǎn)存在差異，CH-1a株的第6、76、80、154、178、185、186位的氨基酸分別為精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、纈氨酸(Val)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)，而HuN4株則分別為蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)。此外，NSP4催化三聯(lián)體His39-Asp64-Ser118序列保守性高，未發(fā)生突變。其中PRRSV NSP4第185位天冬氨酸(Asp)發(fā)生突變，影響NSP4切割核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)必要調(diào)節(jié)蛋白(NEMO)和MAVS的能力，從而調(diào)控IFN-Ⅰ表達(dá)[8]。其他氨基酸突變是否對(duì)空間構(gòu)象造成影響，該影響是否與病毒毒力、細(xì)胞噬性相關(guān)，還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。Wang[9]等發(fā)現(xiàn)NADC30-like株與國(guó)內(nèi)流行疫苗株在NSP4發(fā)生重組，是否影響疫苗效果還需進(jìn)一步研究。

2 NSP4對(duì)病毒復(fù)制影響

在非結(jié)構(gòu)蛋白前體多聚蛋白pp1a和pp1ab加工過(guò)程中，NSP4作為一種重要的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄酶，切割PRRSV增殖過(guò)程中的多聚蛋白，并且NSP4負(fù)責(zé)NSP3～NSP12切割。Tian[10]等通過(guò)人工合成10條多肽并以之為底物(含NSP4預(yù)測(cè)切割位點(diǎn))，通過(guò)“多肽底物-反相高效液相色譜”方法體外測(cè)定蛋白酶活性，發(fā)現(xiàn)NSP4可順式切割NSP4-NSP5，Tian[6]等證實(shí)NSP4可反式切割NSP3-NSP4和NSP11-NSP12，NSP4不能在體外切割NSP8-NSP9[11]。董建國(guó)[7]利用大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化PRRSV HuN4株和CH-1a株NSP4重組蛋白，建立體外測(cè)定NSP4酶動(dòng)力學(xué)方法，以及PRRSV NSP4熒光定量PCR方法，結(jié)果表明CH-1a NSP4體外切割NSP11-NSP12效率高于HuN4株，但HuN4株NSP4基因轉(zhuǎn)錄水平高于CH-1a株，導(dǎo)致整體上HuN4 NSP4酶催化效率高于CH-1a株，進(jìn)而快速切割NSP11-NSP12。NSP11可抑制IFN-β產(chǎn)生和宿主先天性免疫，有利于PRRSV增殖，使得相同時(shí)間內(nèi) HuN4株病毒粒子生成數(shù)量多于CH-1a株。Liu[12]等從含駱駝重鏈抗體可變區(qū)噬菌體展示文庫(kù)中分離出3個(gè)PRRSV NSP4特異性納米抗體(Nb41、Nb42、Nb43)，利用慢病毒載體將納米抗體基因?qū)隡arc-145細(xì)胞，測(cè)試這些細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的納米抗體與PRRSV NSP4是否互作。結(jié)果表明，Nb42識(shí)別NSP4非功能表位，Nb41和Nb43通過(guò)識(shí)別NSP4功能表位抑制PRRSV復(fù)制 ，并在0.001感染復(fù)數(shù)(MOI)或更低感染復(fù)數(shù)下完全阻斷PRRSV復(fù)制。

3 NSP4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

在PRRSV所有結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白中，NSP4作為最主要凋亡誘導(dǎo)蛋白，一方面可激活促凋亡蛋白Bim，另一方面能夠降解抗凋亡蛋白Bcl-xL，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡與其3CLSP密切相關(guān)[13]。在凋亡過(guò)程中，NSP4發(fā)揮生物學(xué)功能需要宿主細(xì)胞蛋白參與，NSP4可以與細(xì)胞色素C1(cyto.c1)蛋白互作。NSP4和cyto.c1能在細(xì)胞質(zhì)中共定位，NSP4剪切cyto.c1蛋白具有劑量依賴性特點(diǎn)，而且NSP4任一酶活性氨基酸位點(diǎn)突變均喪失剪切cyto.c1蛋白能力，cyto.c1蛋白E230aa-G231aa是決定NSP4能否切割cyto.c1蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)[14]。

4 NSP4調(diào)節(jié)宿主免疫

NSP4在調(diào)節(jié)宿主免疫方面發(fā)揮極其重要的作用。NF-κB必要調(diào)節(jié)蛋白NEMO是誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的關(guān)鍵蛋白，仙臺(tái)病毒(SEV)作用于NEMO缺陷型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)時(shí)，MEF由于缺失NEMO使干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)磷酸化過(guò)程受阻，導(dǎo)致IFN-β產(chǎn)生受到抑制。PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)可抑制IFN-β表達(dá)，該抑制作用通過(guò)NSP4切割NEMO途徑實(shí)現(xiàn)。NSP4在細(xì)胞質(zhì)多個(gè)位點(diǎn)與NEMO特異性的相互作用。Chen J Y等研究表明將PRRSV NSP4 第64位的D突變?yōu)锳后，發(fā)現(xiàn)野生型NSP4(NSP-WT)能夠切割宿主蛋白NEMO，而酶活性缺失體不能切割NEMO，得出該切割作用與NSP4酶活性有關(guān)，酶活性缺失體不能抑制IFN-β表達(dá)[15]。

線粒體定位抗病毒蛋白(MAVS也稱IPS-1、VISA或CARDIF)，缺失會(huì)減弱機(jī)體對(duì)IFN-β的誘導(dǎo)作用。不同PRRSV對(duì)IFN-β抑制作用不同，黃琛[16]在PAM驗(yàn)證出HP-PRRSV NSP4比傳統(tǒng)株CH-1a NSP4對(duì)IFN-β抑制作用更強(qiáng)，HP-PRRSV感染明顯下調(diào)VISA蛋白水平，但 CH-1a對(duì)VISA表達(dá)沒(méi)有作用。HP-PRRSV NSP4能夠切割維甲酸誘導(dǎo)基因-I(RIG-I)/黑色素瘤相關(guān)基因5(MDA5)信號(hào)通路中重要接頭分子MAVS及NEMO，NSP4能夠同時(shí)抑制IRF3磷酸化和NF-κB活化。HP-PRRSV NSP4切割MAVS及抑制IFN-β的產(chǎn)生依賴其3CLSP活性，與蛋白酶體和細(xì)胞凋亡途徑無(wú)關(guān)。HP-PRRSV NSP4切割接頭分子MAVS的位點(diǎn)位于MAVS第268位谷氨酸(Gln)，切割之后形成兩個(gè)片段，使得MAVS喪失誘導(dǎo)IFN-β能力。

NSP4抑制IκB激酶復(fù)合體α(IκB kinase α，IκKα)對(duì)IFN-β的誘導(dǎo)表達(dá)。PRRSV NSP4作為一個(gè)絲氨酸蛋白酶與IκKα相互作用，在IκKα兩端特異切割I(lǐng)κKα，NSP4蛋白酶活性在抑制IκKα激活NF-κB通路和IFN-β啟動(dòng)子活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其NSP4保守氨基酸序列His39-Asp64-Ser118催化三聯(lián)體任一位點(diǎn)發(fā)生氨基酸突變都會(huì)影響對(duì)IκKα切割，該結(jié)果有助于揭示PRRSV逃逸宿主天然免疫機(jī)制[17]。

NSP4切割信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活酶2(STAT2)抑制IFN-β表達(dá)。PRRSV NSP4蛋白在拮抗JAK-STAT信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，PRRSV NSP4蛋白依賴其自身絲氨酸蛋白酶活性切割JAK-STAT信號(hào)通路中重要信號(hào)分子STAT2。在JAK-STAT信號(hào)通路傳遞途徑中，STAT2與STAT1結(jié)合形成異源二聚體，NSP4切割STAT2致使異源二聚體缺乏，干擾素刺激基因因子3(ISGF3)復(fù)合體不能與干擾素刺激元件ISRE結(jié)合，拮抗IFN-β生成，同時(shí)鑒定出NSP4切割STAT2位點(diǎn)是E719[18]。

NSP4可通過(guò)多種途徑切割多個(gè)信號(hào)分子來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)IFN-β的調(diào)控，相關(guān)研究表明NSP4氨基酸突變對(duì)NSP4誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生影響。NSP4在細(xì)胞核抑制IFN-β產(chǎn)生，NSP4第155位蘇氨酸(Thr)被賴氨酸(Lys)取代可以增加NSP4在細(xì)胞核中的分布，從而抑制IFN-β體外轉(zhuǎn)錄[19]。HP-PRRSV NSP4第185位天冬氨酸(Asp)發(fā)生突變，會(huì)使NSP4切割NF-κB必要調(diào)節(jié)蛋白(NEMO)和MAVS能力受損，從而拮抗IFN-β產(chǎn)生[8]。

丁國(guó)飛[20]等通過(guò)NSP4蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選到包括轉(zhuǎn)綠因子Snf2相關(guān)CBP激活蛋白(SRCAP)在內(nèi)的42個(gè)可能與NSP4互作細(xì)胞蛋白，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PRRSV感染細(xì)胞后，NSP4與SRCAP互作激活Notch信號(hào)通路，從而促進(jìn)PRRSV的增殖與復(fù)制，揭示了一種全新PRRSV感染機(jī)制。

巨噬細(xì)胞清道夫受體A(SRA又稱CD204)，可以幫助吞噬細(xì)胞識(shí)別致病菌。有報(bào)道PRRSV侵入機(jī)體后，NSP4可通過(guò)直接與SRA啟動(dòng)子-84到-214區(qū)域結(jié)合抑制SRA基因轉(zhuǎn)錄，幫助PRRSV逃逸宿主免疫反應(yīng)。通過(guò)與紫外線(UV)滅活的 PRRSV 比較，未滅活的PRRSV感染抑制 SRA轉(zhuǎn)錄，紫外線UV滅活的PRRSV不能抑制SRA轉(zhuǎn)錄，NSP4調(diào)控 SRA轉(zhuǎn)錄與PRRSV復(fù)制有關(guān)[21]。

豬感染HP-PRRSV會(huì)阻滯豬白細(xì)胞抗原Ⅰ類(SLA-Ⅰ)抗原呈遞途徑。HP-PRRSV感染抑制β2微球蛋白(β2M)的表達(dá)，β2M與SLA-I重鏈和可變肽形成異源三聚體復(fù)合物，在SLA-Ⅰ抗原呈遞過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]。NSP4外源性表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平下調(diào)β2M的表達(dá)，并降低細(xì)胞表面SLA-Ⅰ表達(dá)。

5 NSP4調(diào)控抗病毒反應(yīng)

PRRSV感染Marc-145細(xì)胞顯著下調(diào)外源性鋅指抗病毒蛋白(ZAP)表達(dá)，NSP4利用3CLSP切割ZAP，從而拮抗ZAP抗病毒作用，NSP4第180位絲氨酸(Ser)是降解ZAP所必需，180位氨基酸突變下調(diào)PRRSV降解ZAP能力，從而拮抗其抗病毒作用[23]。楊玉婷[24]通過(guò)Western blot發(fā)現(xiàn)NSP4在E411位點(diǎn)切割ZAP的能力與NSP4含量呈正相關(guān)，自噬溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑不影響NSP4切割ZAP，NSP4酶活突變體喪失對(duì)ZAP切割能力，NSP4切割ZAP依賴3CLSP。mRNA脫帽酶1a(DCP1a)是一種免疫調(diào)節(jié)因子，參與從真核mRNA中去除5′-甲基鳥(niǎo)苷帽，被鑒定為干擾素刺激基因，NSP4也可切割豬mRNA脫帽酶1a(pDCP1a)。PRRSV感染不影響pDCP1a mRNA轉(zhuǎn)錄和亞細(xì)胞定位，通過(guò)切割pDCP1a顯著下調(diào)pDCP1a的表達(dá)，從而致弱pDCP1a抗病毒活性，切割位點(diǎn)位于pDCP1a第238位谷氨酸(E238)[25]。

6 NSP4與宿主相互作用

豬核糖核酸酶L(sRNase L)是一種干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白，sRNase L激活后參與一系列機(jī)體免疫反應(yīng)，抑制PRRSV在宿主細(xì)胞增殖。張梅潔[26]通過(guò)構(gòu)建熒光素酶活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與sRNase L互作的PRRSV蛋白是NSP4、NSP12和N，且在細(xì)胞內(nèi)共定位。尹曼曼[27]篩選PAM cDNA文庫(kù)中與NSP4相互作用的宿主蛋白，發(fā)現(xiàn)豬免疫球蛋白lambda輕鏈相似肽5(sIGLL5)與NSP4互作，NSP4和sIGLL5在HEK-293細(xì)胞共定位。PRRSV感染過(guò)程中，NSP4可通過(guò)與TRIM蛋白家族成員TRIM28互作，介導(dǎo)部分TRIM28以核轉(zhuǎn)錄蛋白CRM1依賴方式從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿中。出核TRIM28作為E3泛素連接酶，使早期自噬調(diào)控分子Vps34發(fā)生類泛素蛋白修飾，增強(qiáng)Vps34和自噬關(guān)鍵調(diào)控蛋白復(fù)合物Beclin1互作，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞自噬體形成[28]。該研究揭示了PRRSV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的新分子機(jī)制，從蛋白翻譯后修飾角度闡明了PRRSV與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制。RBM39(RNA binding motif protein 39)通過(guò)與NSP4互作調(diào)節(jié)c-Jun磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)PRRSV感染[29]。此外NSP4可與F-action和myosin ⅡA互作，完成PRRSV在細(xì)胞之間的傳遞與感染[30]。

7 NSP4在PRRSV檢測(cè)方面應(yīng)用

NSP4在病毒復(fù)制早期出現(xiàn)，并切割其他非結(jié)構(gòu)蛋白，在PRRSV復(fù)制周期中存在較長(zhǎng)時(shí)間，機(jī)體感染早期可檢測(cè)到NSP4抗體，可用于檢測(cè)PRRSV早期感染。同時(shí)，NSP4主要是在病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生，用NSP4作為診斷抗原檢測(cè)NSP4抗體可區(qū)分自然感染與滅活疫苗免疫接種。Brown E[31]等克隆表達(dá)VR2332株NSP1、NSP2、NSP4、NSP7和NSP8，并且以這些蛋白作為包被蛋白分別建立ELISA方法，結(jié)果表明NSP2 ELISA和NSP7 ELISA檢測(cè)效果最好，NSP4 ELISA與待檢血清反應(yīng)弱于前兩者。劉磊[32]等以NSP4重組蛋白作為包被抗原，建立了NSP4抗體ELISA檢測(cè)方法，并與愛(ài)德士IDEXX ELISA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，總符合率為93.19%，結(jié)果說(shuō)明PRRSV NSP4是具有良好潛力的候選蛋白。Cao[33]等開(kāi)發(fā)NSP4蛋白包被間接ELISA(NSP4涂層iELISA)，并將其效果與N涂層iELISA進(jìn)行了比較，結(jié)果表明NSP4涂層和N涂層iELISAs之間一致性為92.2%。此外，檢測(cè)了50份接種HP-PRRSV豬血清樣本，用NSP4包被iELISA檢測(cè)出PRRS抗體陽(yáng)性，但N包被iELISA檢測(cè)結(jié)果陰性，Western blot分析結(jié)果與NSP4包被和NSP2包被iELISA分析結(jié)果一致性分別為92%和96.1%。結(jié)果表明大部分采集自接種活HP-PRRSV菌株的豬血清樣本，其N包被iELISA檢測(cè)結(jié)果陰性，NSP4包被iELISA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，因此使用NSP4包被iELISA可以幫助區(qū)分HP-PRRSV疫苗的假陰性和真陰性反應(yīng)。

8 小結(jié)

PRRSVNSP4參與多種免疫抑制反應(yīng)，NSP4具有3CLSP活性，在PRRSV復(fù)制、抑制宿主IFN-β產(chǎn)生、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡以及在PRRSV檢測(cè)等方面具有重要作用[9,34]。PRRSV NSP4基因保守性較高，不同PRRSV之間氨基酸相似性高，根據(jù)這一特性未來(lái)可開(kāi)發(fā)出針對(duì)PRRSV 的高效新型檢測(cè)試劑與檢測(cè)方法。

PRRSV作為一種免疫抑制性病毒，進(jìn)化出多種策略逃逸宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)。PRRSV除了能抑制IFN-β產(chǎn)生，還可靶向干擾素誘導(dǎo)基因(ISGs)拮抗宿主抗病毒反應(yīng)。研究病毒如何逃逸宿主免疫有助于深入解析宿主免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制。作為PRRSV編碼的一種重要蛋白酶，NSP4在拮抗宿主天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，NSP4除拮抗IFN-Ⅰ信號(hào)通路，還可激活Notch信號(hào)通路、調(diào)控抗原呈遞途徑、參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面協(xié)助病毒逃逸宿主免疫應(yīng)答。NSP4與多種宿主蛋白互作，NSP4具有切割宿主蛋白的作用，這可能成為PRRSV 逃逸宿主免疫反應(yīng)的主要機(jī)制之一。深入研究PRRSV NSP4調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)機(jī)制有助于深入了解PRRSV致病機(jī)理并確定其毒力因子，以此為前提可為弱化PRRSV、開(kāi)發(fā)有效疫苗提供新靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

PRRSV NSP4作為主要蛋白酶之一，在病毒增殖中發(fā)揮重要作用，3C樣絲氨酸蛋白酶特征成為藥物設(shè)計(jì)重要靶點(diǎn)[17,19]。納米抗體作為治療PRRSV感染的新型抗病毒藥物，有巨大發(fā)展?jié)摿Αhi[35]團(tuán)隊(duì)開(kāi)展靶向NSP4抗病毒藥物篩選，得到2種抑制效果顯著的抗病毒候選藥物。迄今為止，PRRSV仍在全球流行，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，有效防控PRRSV仍是世界性難題，研究PRRSV分子致病機(jī)制可為預(yù)防與控制該病提供科學(xué)依據(jù)。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第12篇

題目：貓毛滴蟲(chóng)病研究進(jìn)展

毛滴蟲(chóng)是一類屬于副基體門的原蟲(chóng)，以寄生或共生形式、厭氧生活在宿主胃腸道或生殖道，多有3根～5根前鞭毛、氫酶體、副基體及復(fù)雜的細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)[1-2]。貓毛滴蟲(chóng)感染已報(bào)道的蟲(chóng)種有寄生于貓腸道的胎兒三毛滴蟲(chóng)(Tritrichomonasfoetus)和人五毛滴蟲(chóng)(Pentatrichomonashominis)及寄生于貓口腔中的口腔毛滴蟲(chóng)(Trichomonastenax)、布里克西毛滴蟲(chóng)(Trichomonasbrixi)和貓四毛滴蟲(chóng)(Tetratrichomonasfelistomae)等[2-3]。T.foetus是引起貓毛滴蟲(chóng)病的病原，臨床上以慢性大腸性腹瀉為特征[4]。分子分析顯示牛和貓T.foetus分離株在遺傳上有一定差異，分屬于T.foetus的“牛基因型”和“貓基因型”[4-5]。貓作為伴侶動(dòng)物，與人接觸密切，這引發(fā)了人們關(guān)于貓是否可引起毛滴蟲(chóng)人獸共患傳播風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂。

1 發(fā)現(xiàn)歷史

貓毛滴蟲(chóng)的研究可追溯到20世紀(jì)20年代，Da Cunha A M和Muniz J將其命名為貓毛滴蟲(chóng)(Trichomonasfelis)。1996年,Romatowski J基于光鏡觀察，把貓糞中的滴蟲(chóng)鑒定為P.hominis;2001年Levy MG首次用分子方法證實(shí)T.foetus才是貓滴蟲(chóng)性腹瀉的真正病原[6-7]。

2 病原與生活史

毛滴蟲(chóng)僅有滋養(yǎng)體階段，通過(guò)縱二分裂進(jìn)行繁殖，不同蟲(chóng)種滋養(yǎng)體形態(tài)相似，均呈紡錘形或淚滴狀，具特定數(shù)量的前鞭毛和1 根與波動(dòng)膜邊緣連接的后鞭毛，蟲(chóng)體運(yùn)動(dòng)活潑[1]。其中，T.foetus有3根前鞭毛，P.hominis有5根前鞭毛，T.tenax有4根前鞭毛。目前認(rèn)為貓T.foetus主要經(jīng)糞-口途徑傳播，而寄生于口腔的毛滴蟲(chóng)通過(guò)飛沫或接觸傳播[3,6,9]。

3 致病性

3.1 胎兒三毛滴蟲(chóng)

貓毛滴蟲(chóng)病作為一種新發(fā)的貓胃腸道疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。自然感染情況下，T.foetus主要定植在黏膜表面，并與盲腸和結(jié)腸的表面上皮接觸。人工感染試驗(yàn)可觀察到蟲(chóng)體定植在貓回腸末端、盲腸和結(jié)腸。體外研究表明，T.foetus可經(jīng)特異性配體-受體互作直接黏附在單層腸上皮細(xì)胞上[10]。半胱氨酸蛋白酶似乎可介導(dǎo)蟲(chóng)體在腸黏膜上皮的黏附和細(xì)胞毒作用，未來(lái)可作為改善該病臨床癥狀的治療目標(biāo)[11]。

3.2 口腔毛滴蟲(chóng)

T.tenax感染多見(jiàn)于口腔衛(wèi)生較差或具牙周疾病的人群[3]。雖然T.tenax具較高蛋白水解活性，可破壞寄生部位黏膜和組織，但普遍認(rèn)為其與宿主是一種共生關(guān)系[9]。

4 臨床癥狀

貓毛滴蟲(chóng)病臨床癥狀多變，感染較輕時(shí)呈亞臨床癥狀，嚴(yán)重感染時(shí)出現(xiàn)慢性頑固性腹瀉。人工口服攻蟲(chóng)后，貓可出現(xiàn)慢性或間歇性腹瀉，糞便呈半成形，半流質(zhì)或液態(tài)，黃綠色，惡臭，有時(shí)有糞便帶血、黏液，大便失禁、里急后重，腸胃脹氣等癥狀，可持續(xù)2 d～7 d。嚴(yán)重感染病例，會(huì)出現(xiàn)明顯肛門炎癥和直腸脫垂等[1,6]。上述臨床癥狀多呈間歇性，在使用藥物治療后好轉(zhuǎn)，停藥后可復(fù)發(fā)[12]。

5 流行

5.1 貓腸道毛滴蟲(chóng)

貓T.foetus呈全球流行，貓T.foetus感染率為0～81.8%，見(jiàn)表1[6]。不同的研究者調(diào)查時(shí)采用的方法不盡相同，早期的調(diào)查多采用培養(yǎng)法和直接涂片鏡檢，近期多采用分子方法，一些國(guó)家僅有貓T.foetus病例報(bào)道，尚無(wú)貓群中T.foetus流行的相關(guān)數(shù)據(jù)可供參考[13]。現(xiàn)有研究中，調(diào)查樣本來(lái)源多樣，如采集自腹瀉貓、參加會(huì)展的貓、寄養(yǎng)貓、或獸醫(yī)診所就診貓等，有的樣本有臨床癥狀，有的無(wú)臨床癥狀等，因此現(xiàn)有流行數(shù)據(jù)可能存在與此類樣本、調(diào)查方法等相關(guān)聯(lián)的偏差[13]。一些早期病例報(bào)道中，曾把T.foetus誤判為P.hominis。近期關(guān)于貓P.hominis流行的報(bào)道也不多，目前僅見(jiàn)日本寵物店貓P.hominis感染率為0.5%(2/409)，國(guó)內(nèi)某動(dòng)物醫(yī)院門診貓P.hominis感染率為5.3%(3/57)，且存在T.foetus和P.hominis混合感染，混合感染率為3.5%(2/57)[15-16]。

表1 全球貓T.foetus流行情況

5.2 貓口腔毛滴蟲(chóng)

Kellerov P和Tachezy J[3]報(bào)道捷克貓T.tenax感染率為4.1%(5/111)，T.brixi感染率為6.6%(7/111)。Dybicz M等[5]報(bào)道波蘭貓T.tenax感染率為2.1%(3/142)。

6 診斷

常用的診斷毛滴蟲(chóng)病的方法有直接濕片鏡檢法、糞便培養(yǎng)法和PCR法。毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)環(huán)境較敏感，其診斷對(duì)糞便樣本有較高的要求。待分析糞便必須新鮮、無(wú)污染，且測(cè)試前不要冷凍。最好采集剛排出的新鮮糞便或用糞圈或結(jié)腸沖洗技術(shù)人工提取糞便[1,6,17]。如樣本需運(yùn)輸，可用鹽水(每2 g糞便用3 mL生理鹽水)稀釋，防止干燥以延長(zhǎng)毛滴蟲(chóng)存活時(shí)間。為提高檢測(cè)敏感性，糞便樣品最好在6 h內(nèi)分析完畢，如超過(guò)6 h，會(huì)降低檢測(cè)敏感性[1]。非腹瀉貓的糞便或干結(jié)糞便，不適合用于毛滴蟲(chóng)檢測(cè)，因即使存在感染，也很少會(huì)有陽(yáng)性結(jié)果。在貓服用抗生素的情況下采樣，會(huì)降低毛滴蟲(chóng)檢出率，因此在采樣前，最好提前幾天停用任何類型的抗菌治療[1]。

6.1 直接濕片鏡檢法

將少量糞便用生理鹽水稀釋后，蓋上蓋玻片，置200×或400×鏡下檢查，即“濕片”法。觀察時(shí)，可根據(jù)滋養(yǎng)體形狀和運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體，一旦蟲(chóng)體不運(yùn)動(dòng)或死亡，則很難檢出。該法操作簡(jiǎn)單、成本低，但檢測(cè)敏感度較低，其中人工感染貓檢出率低于2%，自然感染貓檢出率約4%。實(shí)踐中，可用新鮮、非冷藏(凍)和腹瀉貓糞便及多次涂片檢查等提高檢出率[6]。此外，該法不能區(qū)分T.foetus和P.hominis等不同毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)種，同時(shí)因T.foetus滋養(yǎng)體大小與賈第蟲(chóng)包囊大小相似，容易混淆，鏡檢時(shí)要注意排除干擾。 對(duì)T.tenax，則直接取貓口腔刮取物，用生理鹽水稀釋、涂片后鏡檢。

6.2 糞便培養(yǎng)法

如糞便經(jīng)多次鏡檢仍為陰性，可用商業(yè)化的In Pouch TF培養(yǎng)基進(jìn)行蟲(chóng)體培養(yǎng)。該法僅需少量糞便(米粒大小即可)，敏感性比直接鏡檢高，自然感染貓檢出率約55%。因賈第蟲(chóng)不能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，可排除賈第蟲(chóng)包囊對(duì)結(jié)果的干擾[1]。但該法耗時(shí)較長(zhǎng)，需幾天時(shí)間讓蟲(chóng)體增殖以提高檢出率，且該法也不能區(qū)分不同毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)種。此外，也可用Diamond或改良Diamond培養(yǎng)基等對(duì)糞便進(jìn)行培養(yǎng)后檢測(cè)。

6.3 PCR方法

目前，已發(fā)展了多種檢測(cè)貓毛滴蟲(chóng)的PCR方法，主要擴(kuò)增的靶基因?yàn)槊蜗x(chóng)5.8S rRNA的ITS1和ITS2區(qū)。最常用的方法是巢式PCR法，第一對(duì)引物為TFR3和TFR4(擴(kuò)增347 bp的片段)，第二對(duì)引物為TFITS-F和TFITS-R(擴(kuò)增208 bp的片段)[18]。已證實(shí)引物對(duì)Th3/Th5是P.hominis特異的，在其基礎(chǔ)上發(fā)展出的單輪和巢式PCR方法是較為常用的方法[22-23]。Kikuta N等[21]發(fā)展了一種特異檢測(cè)T.tenax的PCR方法。PCR方法的敏感性和特異性均優(yōu)于糞便培養(yǎng)法和直接濕片鏡檢法，所需時(shí)間比培養(yǎng)法短，且不要求必須是活蟲(chóng)體，死亡蟲(chóng)體也可檢測(cè)，可檢測(cè)至最低10個(gè)蟲(chóng)體/100 mg糞便[22]。但因糞便成分復(fù)雜，如多糖復(fù)合物、膽鹽、血紅蛋白降解產(chǎn)物、酚類化合物和重金屬等PCR抑制劑常與蟲(chóng)體DNA共同提取，會(huì)降低檢測(cè)的敏感性，導(dǎo)致出現(xiàn)“假陰性”[6]。

6.4 組織病理學(xué)方法

組織病理學(xué)法可作為檢測(cè)腸組織中P.hominis/T.foetus滋養(yǎng)體的一種診斷方法，但因滋養(yǎng)體極其脆弱，很難保存在活檢標(biāo)本中，因此檢測(cè)結(jié)果并不準(zhǔn)確[6]。使用該法時(shí)，對(duì)同一樣本，需檢查至少6個(gè)組織切片，以獲得至少95%的置信度[1]。免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交與顯色雜交技術(shù)也可應(yīng)用于組織標(biāo)本中毛滴蟲(chóng)的檢測(cè)，但不易推廣應(yīng)用。

7 治療

通常治療人陰道毛滴蟲(chóng)等腸道原蟲(chóng)的藥物，如甲硝唑和替硝唑，在治療貓毛滴蟲(chóng)病時(shí)效果不佳。羅硝唑(RDZ)是迄今唯一已證實(shí)對(duì)貓T.foetus有效的藥物，通常按每天20 mg/kg～30 mg/kg劑量口服，連用14 d[1]。在用RDZ治療期間，大多數(shù)感染貓的糞便稠度能快速改善，一般在治療2周后正常[1]。但一些結(jié)腸損傷嚴(yán)重的病例，治療數(shù)周腹瀉仍不見(jiàn)好轉(zhuǎn)。因從腸道徹底清除毛滴蟲(chóng)難度較大，用RDZ治療后，毛滴蟲(chóng)病可能會(huì)復(fù)發(fā)，但經(jīng)多次治療的貓可痊愈[23]。用芬苯達(dá)唑、帕羅霉素、替硝唑和甲硝唑等治療毛滴蟲(chóng)病時(shí)，治療期間，貓糞便狀況有所改善，但停藥后腹瀉經(jīng)常重現(xiàn)[6]。有報(bào)道顯示貓毛滴蟲(chóng)可對(duì)RDZ產(chǎn)生抗藥性，但感染貓群中抗藥性蟲(chóng)株的流行情況不甚清楚[24]。高劑量應(yīng)用RDZ，可使貓產(chǎn)生食欲減退、顫抖、虛弱、共濟(jì)失調(diào)和感覺(jué)過(guò)敏等副作用。因副作用的存在，只有在已明確確診為毛滴蟲(chóng)感染的病例、且已征得貓主人同意，才建議應(yīng)用RDZ治療[12]。

目前報(bào)道的其他治療貓毛滴蟲(chóng)病的方法較少。許多有效治療腹瀉的辦法如改變飲食，使用不同類抗菌素、益生菌和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑等，對(duì)治療貓毛滴蟲(chóng)病效果均不明顯[25]。

8 預(yù)后

貓毛滴蟲(chóng)病的預(yù)后往往良好，感染T.foetus的貓仍可保持正常身體條件和生理狀態(tài)。88%的腹瀉貓，其糞便可在感染2年后自然恢復(fù)正常。平均腹瀉持續(xù)時(shí)間為135 d。然而，T.foetus感染很難自發(fā)消除，暗示貓很難對(duì)T.foetus感染產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，約54%的貓存在持續(xù)感染或再次感染，或間歇性腹瀉反復(fù)發(fā)作等，推測(cè)可能與應(yīng)激或腸道菌群變化相關(guān)。此外，慢性感染可能會(huì)使部分貓發(fā)展為炎癥性腸病[6,12]。

鑒于貓毛滴蟲(chóng)病預(yù)后良好，當(dāng)感染發(fā)生后，治療與否成為一個(gè)必須抉擇的問(wèn)題。歐洲貓科疾病咨詢委員會(huì)推薦，僅當(dāng)腹瀉的貓經(jīng)直接濕片鏡檢和糞便培養(yǎng)后鏡檢為毛滴蟲(chóng)陽(yáng)性時(shí)，建議進(jìn)行治療[1]。很多貓感染后無(wú)臨床癥狀，但其可能成為潛在的傳染來(lái)源。因此，建議所有經(jīng)檢測(cè)毛滴蟲(chóng)陽(yáng)性的貓，無(wú)論有無(wú)癥狀，均應(yīng)進(jìn)行治療，以盡量減少該病的傳播。

9 預(yù)防

因應(yīng)激或免疫功能發(fā)育不成熟，在擁擠環(huán)境中飼養(yǎng)的小貓更易發(fā)生T.foetus感染。因此，減少應(yīng)激，避免密集飼養(yǎng)，以盡量減少接觸或感染T.foetus的機(jī)會(huì)。此外，應(yīng)對(duì)所有被T.foetus污染的貓舍、床、被褥、運(yùn)輸箱、垃圾箱等進(jìn)行徹底消毒，以殺死污染的滋養(yǎng)體[6,12]。

10 展望

貓毛滴蟲(chóng)病作為一種貓的新發(fā)傳染病，已引起獸醫(yī)界的關(guān)注。目前對(duì)該病的研究遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期，尤其急需有效、安全的治療辦法。繼續(xù)開(kāi)展貓毛滴蟲(chóng)病的病原學(xué)、流行病學(xué)、傳播模式、致病性、人獸共患潛力等研究，有助于更全面的掌握其情況，從而為防控奠定基礎(chǔ)。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第13篇

題目：牛呼吸道疾病兩種細(xì)菌性病原研究進(jìn)展

牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease，BRD)是一種由多種因素引起的綜合征，包括環(huán)境和管理相關(guān)的應(yīng)激源以及多種病毒和細(xì)菌病原體，給北美和世界養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前仍然是影響北美地區(qū)肉牛最常見(jiàn)和損失最大的疾病，也是引起奶牛發(fā)病和死亡的重要原因[1]。我國(guó)目前尚未研制防控BRD的相關(guān)疫苗，防控措施較為單一，建議深入開(kāi)展致病機(jī)理及防控技術(shù)研究，開(kāi)發(fā)有效的診斷試劑與疫苗，對(duì)高效防控該類疾病，保障養(yǎng)牛業(yè)的健康、快速、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[2-3]。Dubrovsky S A等[4]報(bào)道美國(guó)加州的飼養(yǎng)場(chǎng)中BRD的發(fā)病率約為75%和病死率接近50%;育肥場(chǎng)的發(fā)病率更高，初步估計(jì)發(fā)病率和病死率約為90%。而在奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中，斷奶犢牛BRD的發(fā)病率約為22%和病死率約20%，也是導(dǎo)致斷奶前犢牛死亡的主要原因。

BRD的發(fā)生是由多種因素引起并最終導(dǎo)致受感染牛表現(xiàn)臨床癥狀，但引起發(fā)病的細(xì)菌性病原體主要是溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)[5]。這些病原體已經(jīng)適應(yīng)并定植于呼吸道黏膜表面，從而逃避宿主的免疫反應(yīng);適應(yīng)機(jī)制包括表達(dá)黏附素、產(chǎn)生和分泌毒素與蛋白酶以及形成生物膜。耐藥性是BRD病原菌中的一個(gè)新問(wèn)題，而Mh廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)菌株的分離越來(lái)越普遍[6-7]。本文對(duì)引起B(yǎng)RD的兩種主要細(xì)菌性病原體的生物學(xué)特性、免疫逃避和致病機(jī)制、耐藥性與耐藥現(xiàn)狀及多重耐藥的遺傳機(jī)制，以及這些因素如何影響對(duì)此類疾病的診斷、治療和療效等進(jìn)行簡(jiǎn)要概述，以期為我國(guó)防控該病提供參考。

1 Mh與Pm概述

Mh和Pm是巴斯德菌科的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，通常定植于臨床健康牛的口咽部黏膜上。一般來(lái)說(shuō)，這些微生物引起牛的臨床疾病是由應(yīng)激、免疫抑制和病毒感染的共同作用導(dǎo)致的，最終導(dǎo)致其在下呼吸道的過(guò)度生長(zhǎng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明其具有傳染性，至少M(fèi)h可在種群內(nèi)傳播[8-9]。

多殺性巴氏桿菌由5種莢膜血清型(A、B、D、E、F)和16種菌體血清型(1-16)。相比之下，溶血性曼氏桿菌至少由12種莢膜血清型(1、2、5-9、12-14、16和17)組成。對(duì)于兩種病原體，莢膜血清型是引起宿主特異性和致病性的原因。盡管存在不同的血清型，但臨床疾病多集中在莢膜血清A1型Mh(>75%的病例)和莢膜血清A3型Pm(肉牛>30%和奶牛>60%的病例)。Cozens D等[10]的研究表明，A1型Mh的特異性毒力因子促進(jìn)了其在牛呼吸道上皮細(xì)胞的侵襲，使其能夠進(jìn)行不受控制的復(fù)制并擴(kuò)散到鄰近的細(xì)胞;一旦進(jìn)入細(xì)胞，能對(duì)受感染的組織造成廣泛的損害，同樣的現(xiàn)象沒(méi)有在呼吸道共棲的血清型中發(fā)現(xiàn)[10]。

除了莢膜型外，這兩種微生物都是革蘭氏陰性菌，其特征是細(xì)胞外壁存在脂多糖(LPS)。內(nèi)毒素是一種強(qiáng)有力的促炎介質(zhì)，可觸發(fā)細(xì)胞因子的釋放，并刺激炎癥細(xì)胞的涌入，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。此外，內(nèi)毒素與白細(xì)胞毒素協(xié)同作用可以增強(qiáng)Mh的致病性。

2 Mh與Pm的免疫逃避和致病機(jī)理

許多革蘭氏陰性病原體已經(jīng)進(jìn)化出在黏膜表面定植并增強(qiáng)細(xì)菌與宿主相互作用的機(jī)制。隨著時(shí)間的推移，對(duì)強(qiáng)毒株的詳細(xì)研究使得各種影響因素為人所知，這些因素使Mh和Pm在逃避宿主免疫反應(yīng)或增強(qiáng)臨床疾病方面沒(méi)有差異(表1)[5]。這種能力是很重要的，因?yàn)榱私庵虏〉牟煌玖σ蜃涌赡苡兄陂_(kāi)發(fā)出以增強(qiáng)對(duì)這些化合物的免疫力為中心的控制策略。

表1 溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的免疫逃避機(jī)制和毒力因子

Mh和Pm都能產(chǎn)生一系列黏附素，這些黏附素允許上皮細(xì)胞附著并防止吞噬作用[5]。例如，莢膜 A型Pm的莢膜由透明質(zhì)酸組成，這種莢膜增強(qiáng)了與呼吸道上皮細(xì)胞的結(jié)合和在下呼吸道的定植。此外，Mh產(chǎn)生一種纖維蛋白原結(jié)合蛋白，該蛋白包裹在細(xì)菌細(xì)胞表面，阻止補(bǔ)體結(jié)合，從而降低調(diào)理作用[5]。值得注意的是，這些病原微生物的其他血清型的莢膜是由與宿主組織成分非常相似的物質(zhì)(如肝素、軟骨素)組成的，這可能導(dǎo)致它們的抗原性較差。

這些病原體還有其他幾種逃避和操縱宿主免疫系統(tǒng)的方法。例如，免疫球蛋白(Ig)A-特異性蛋白酶系列可以裂解IgA并阻止其與病原體結(jié)合[11]。這些蛋白酶的最終作用是防止調(diào)理作用或補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷。此外，Mh具有在呼吸道中形成生物膜的能力，生物膜是一種由多糖、蛋白質(zhì)和DNA組成的聚合物包裹的有組織的細(xì)菌群落，是細(xì)菌適應(yīng)生活在潛在的惡劣環(huán)境中的一種手段[11]。在健康的宿主中，大多數(shù)Mh可能存在于口咽和扁桃體隱窩的生物膜中。在生物膜內(nèi)，細(xì)菌可以免受抗菌藥物和宿主免疫反應(yīng)的影響。當(dāng)病原微生物處于生物膜而非浮游狀態(tài)時(shí)，許多抗菌藥物對(duì)Mh的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)倍增[12]。此外，研究表明，宿主產(chǎn)生的應(yīng)激性化學(xué)物質(zhì)(P物質(zhì)、去甲腎上腺素、腎上腺素)可以促進(jìn)生物膜擴(kuò)散，生物膜是一種能夠從上呼吸道向下呼吸道運(yùn)動(dòng)的因子，并將應(yīng)激與臨床BRD聯(lián)系起來(lái)[13]。

白細(xì)胞毒素是一種由Mh產(chǎn)生的與臨床疾病相關(guān)的重要毒力因子，這種毒素的重要性與Mh致病性直接相關(guān)。因此，在設(shè)計(jì)Mh的控制方案時(shí)，必須首先考慮白細(xì)胞毒素的影響。白細(xì)胞毒素是毒素(repeat in toxin，RTX)家族中的重復(fù)序列，在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所有Mh均可產(chǎn)生[6]。白細(xì)胞毒素可特異性地與牛中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞表面的分化簇(cluster of differentiation，CD)18相互作用，一旦與之接觸，中性粒細(xì)胞就會(huì)脫顆粒并釋放有效的消化酶進(jìn)入周圍組織。此外，白細(xì)胞毒素刺激組織肥大細(xì)胞的脫顆粒和血管活性介質(zhì)的釋放。如前所述，內(nèi)毒素和白細(xì)胞毒素具有協(xié)同作用，內(nèi)毒素是一種有效的趨化劑，可使中性粒細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞進(jìn)入呼吸道。此外，內(nèi)毒素的釋放有助于CD18在炎性細(xì)胞表面的上調(diào)表達(dá)。因此，更多的細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞毒素具有更高親和力，其存在可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床疾病發(fā)生[5]，如Mh經(jīng)常與典型的纖維蛋白性胸膜肺炎的發(fā)生相關(guān)。

3 Mh與Pm的耐藥性

獸醫(yī)最關(guān)心的是細(xì)菌的臨床抗藥性，他們感興趣的是某種特定抗菌藥物能有效治療被某種特定病原體感染而導(dǎo)致某種疾病的動(dòng)物[14]。臨床耐藥的概念是基于臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)——獸醫(yī)抗菌藥物敏感性測(cè)試委員會(huì)制定的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)，具體如下：一是特定細(xì)菌病原體代表性群體的抗菌藥物的體外最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)范圍;二是通過(guò)藥物濃度與微生物敏感性之間的關(guān)系，建立的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)的參數(shù);三是在目標(biāo)物種中進(jìn)行臨床試驗(yàn)的結(jié)果[15]。

對(duì)于BRD病原體，CLSI批準(zhǔn)了針對(duì)青霉素(僅限于肉湯稀釋法)、頭孢噻呋、達(dá)氟沙星(danofloxacin)、恩諾沙星、氟苯尼考、硫酸大觀霉素、拖拉霉素(tulathromycin)、加米霉素(gamithromycin)、泰地羅新(tildipirosin)和替米考星(tilmicosin)的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)[16];對(duì)于這些抗菌藥物，敏感性結(jié)果表明治療成功的可能性明顯大于耐藥性結(jié)果。這些藥敏結(jié)果僅適用于按照抗菌藥物使用說(shuō)明進(jìn)行，且藥敏試驗(yàn)采用CLSI批準(zhǔn)的方法和解釋標(biāo)準(zhǔn)的情況下，然而藥敏試驗(yàn)與臨床結(jié)果之間的關(guān)系并不完善。同樣有一點(diǎn)非常重要，我們必須認(rèn)識(shí)到抗菌藥物藥敏試驗(yàn)不能保證在單個(gè)動(dòng)物身上得到特定的臨床結(jié)果。試圖通過(guò)體外測(cè)試獲得的藥敏結(jié)果來(lái)推斷體內(nèi)反應(yīng)，疾病結(jié)果通常受到諸如宿主免疫狀態(tài)、個(gè)體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化或疾病嚴(yán)重程度增加/病程延長(zhǎng)等因素的影響。對(duì)于沒(méi)有CLSI批準(zhǔn)的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)的抗菌藥物，已從其他物種的血漿和組織液中推斷獲得，例如青霉素G(紙片擴(kuò)散法)、四環(huán)素(紙片擴(kuò)散法)、強(qiáng)化磺胺類藥物、氨基糖苷類藥物和紅霉素等藥物[17]。對(duì)于這些抗菌藥物而言敏感結(jié)果優(yōu)于耐藥性結(jié)果，但是目前尚無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)可將敏感性測(cè)試結(jié)果與牛BRD的預(yù)期結(jié)果相關(guān)聯(lián)。

第二種耐藥性是根據(jù)監(jiān)測(cè)細(xì)菌野生型種群中藥物敏感性分布特征變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行定義的[18]。這些流行病學(xué)臨界值沒(méi)有提供與臨床結(jié)果相關(guān)的數(shù)據(jù)，而是代表了MIC與原始細(xì)菌種群的偏差，可以用來(lái)指示耐藥性決定因素的出現(xiàn)。因此，流行病學(xué)臨界值可能表明MIC的耐藥性與臨床藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)有所不同(通常更低)。此外，盡管文中提到的許多研究可能涉及多種抗菌藥物，但僅討論CLSI已建立敏感性結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)的藥物;病原體為Mh、Pm和睡眠嗜血桿菌(Histopilussomni，Hs)，抗菌藥物為頭孢噻呋、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、加米霉素、青霉素、大觀霉素、四環(huán)素、泰地羅新、拖拉菌素、替米考星(僅適用于Mh)。

4 Mh與Pm的流行率與耐藥模式

最早建立的Mh與Pm的MIC分布是利用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室診斷方法和CLSI批準(zhǔn)的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)1988年至1992年期間死于BRD的動(dòng)物調(diào)查得出的[19];在這項(xiàng)研究中，對(duì)美國(guó)和加拿大20多個(gè)州的461株Mh和318株P(guān)m菌株進(jìn)行MIC測(cè)定，結(jié)果表明Mh和Pm分離菌株100%對(duì)頭孢噻呋敏感，83.5%和83.3%對(duì)大觀霉素敏感，57% 和70.5%對(duì)四環(huán)素敏感，69.1%和未測(cè)試對(duì)替米考星敏感。值得注意的是，研究中使用的替米考星的解釋標(biāo)準(zhǔn)在Mh與Pm上均未通過(guò)驗(yàn)證;按照目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，使用該藥物的耐藥性將顯著降低(>90%敏感)。對(duì)1994年至2002年俄克拉荷馬州死于BRD的肉牛肺中分離獲得的390株Mh和292株P(guān)m耐藥性進(jìn)行研究，結(jié)果表明四環(huán)素和大觀霉素的敏感性各不相同且較低，氟苯尼考和替米考星與頭孢噻呋和恩諾沙星的結(jié)果正好相反，敏感性很高且相對(duì)穩(wěn)定[20]。對(duì)2000年至2009年間美國(guó)和加拿大收集的Mh(n=2 977)和Pm(n=3 291)分離株進(jìn)行藥物敏感性評(píng)估，結(jié)果顯示頭孢噻呋對(duì)兩種病原體均保持高度敏感且一致(100%敏感)，對(duì)達(dá)氟沙星、恩諾沙星和氟苯尼考的敏感性隨時(shí)間的推移保持穩(wěn)定，而對(duì)替米考星和拖拉菌素的敏感性均下降[21]。一項(xiàng)來(lái)自堪薩斯州立大學(xué)的對(duì)細(xì)菌多重耐藥性和共同耐藥模式的研究，被認(rèn)為具有里程碑意義，該研究評(píng)估了2009年至2011年期間從患有BRD的牛肺部分離的Mh分離菌株;研究結(jié)果表明分離株對(duì)5種或5種以上抗菌藥物的耐藥性比例從5%增加到35%，對(duì)土霉素或替米考星耐藥的菌株，至少對(duì)另外1種抗菌藥物的耐藥性明顯更高[22]。

研究人員對(duì)到達(dá)和離開(kāi)育肥場(chǎng)的牛就抗菌藥物的耐藥性進(jìn)行了多項(xiàng)研究。Klima C L等[23]對(duì)阿爾伯塔省南部2個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)，在進(jìn)入時(shí)和離開(kāi)前30 d內(nèi)選取30%圈舍采集10%的動(dòng)物鼻拭子樣本，用于Mh的分離和藥敏試驗(yàn)，獲得了409株Mh，藥敏結(jié)果顯示對(duì)所有抗菌藥物的耐藥性從0.2%到3.9%不等且都很低，其中對(duì)土霉素普遍耐藥;值得注意的是，該研究中許多被評(píng)估的抗菌藥物，CLSI沒(méi)有明確由Mh引起的BRD的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)，這使得研究中的一些結(jié)論難以解釋。Noyes N R等[16]對(duì)加拿大4個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)按照到達(dá)時(shí)和離開(kāi)前的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采集深部鼻咽(deep nasopharyngeal，DNP)拭子，獲得2 989株Mh，評(píng)估21種不同抗菌藥物的敏感性，耐藥性很少見(jiàn)，87%的菌株對(duì)所有抗菌藥物都敏感。值得注意的是該研究與Klima的相似，許多被評(píng)估的抗菌藥物， CLSI沒(méi)有解釋標(biāo)準(zhǔn)。一項(xiàng)來(lái)自加拿大的研究評(píng)估了從健康和患有BRD的牛身上分離出Mh的耐藥模式， 18%的分離菌株具有耐藥性[17]。總的來(lái)說(shuō)，收集于BRD牛的分離株(32%)比健康牛 (2%)更容易產(chǎn)生耐藥性。分離菌株普遍對(duì)四環(huán)素耐藥，一般來(lái)說(shuō)，如果分離株對(duì)一種藥物耐藥，它也至少對(duì)一種其他的抗菌藥物耐藥[17]。

Snyder E等[7]評(píng)估了使用長(zhǎng)效大環(huán)內(nèi)酯類藥物拖拉霉素預(yù)防Mh耐藥性的流行情況，取得了令人驚訝的結(jié)果。犢牛在進(jìn)入育肥場(chǎng)之前被給予拖拉霉素以防止BRD發(fā)生，在抵達(dá)當(dāng)天采集DNP拭子，10 d～14 d后再采集1次。結(jié)果表明與在抵達(dá)時(shí)相比，對(duì)于除頭孢噻呋外的所有抗菌藥物，第二次被劃分為中介或耐藥的分離株比例顯著增加。第二次藥敏結(jié)果顯示0.8%表現(xiàn)為敏感， 24.4%對(duì)2種抗菌藥物(氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類)中介或耐藥， 74.8%對(duì)3種抗菌藥物(氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類以及酚類或頭孢菌素類)表現(xiàn)為中介或耐藥[7]。評(píng)估恩諾沙星和拖拉菌素在治療和預(yù)防犢牛BRD中的療效和耐藥性時(shí)得出了與Snyder類似的結(jié)果。Woolums A R等[18]進(jìn)行的相關(guān)研究也得出了類似的結(jié)果，使用大劑量泰地羅新進(jìn)行藥物治療后采集DNP拭子，分離鑒定的Mh分離株幾乎對(duì)除頭孢噻呋外的所有藥物均具有耐藥性，且100%屬于多重耐藥(multidrug resistance，MDR)。

綜上所述，許多有關(guān)BRD主要細(xì)菌性病原體耐藥性的研究工作都來(lái)自飼養(yǎng)場(chǎng)和育肥場(chǎng)。而在養(yǎng)殖場(chǎng)中，關(guān)于耐藥性的研究相對(duì)較少。來(lái)自瑞士的Pipoz F等[19]收集了來(lái)自52個(gè)奶牛群的中犢牛臨床樣本，對(duì)樣本中Mh和Pm分離菌株的耐藥流行情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明Mh(n=8)分離菌株對(duì)四環(huán)素、恩諾沙星、青霉素、頭孢噻呋、大觀霉素和氟苯尼考敏感;相比之下，Pm(n=37)分離菌株對(duì)恩諾沙星、頭孢噻呋、大觀霉素和氟苯尼考敏感，但對(duì)替米考星呈現(xiàn)中介，對(duì)四環(huán)素呈現(xiàn)耐藥。Owen J R等[20]評(píng)估了美國(guó)加利福尼亞的一個(gè)育肥場(chǎng)和飼養(yǎng)場(chǎng)采集的犢牛鼻拭子中分離出的Mh和Pm菌株耐藥性的流行情況，結(jié)果顯示Mh和Pm分離株對(duì)頭孢噻呋和恩諾沙星敏感，其中大多數(shù)Pm分離株對(duì)青霉素和托拉菌素敏感，超過(guò)50%對(duì)達(dá)氟沙星耐藥，30%對(duì)氟苯尼考耐藥，90%以上的對(duì)四環(huán)素和替米考星耐藥;所有的Mh分離株均對(duì)大觀霉素敏感，20%對(duì)達(dá)氟沙星、拖拉菌素和氟苯尼考耐藥，30%對(duì)替米考星耐藥，有60%對(duì)青霉素耐藥。一項(xiàng)來(lái)自Snyder E等[5]的最新研究，收集了加利福尼亞一個(gè)牧場(chǎng)的100頭診斷為BRD的奶牛樣本(經(jīng)鼻腔清洗、支氣管肺泡灌洗液的DNP拭子)，對(duì)樣本中分離的Mh(n=53)和Pm(n=175) 進(jìn)行了藥物敏感性評(píng)估，結(jié)果顯示多數(shù)Pm(>90%)分離菌株對(duì)氨芐西林、頭孢噻呋、青霉素、大觀霉素和托拉菌素敏感，但對(duì)恩諾沙星和氟苯尼考耐藥;相比之下，大多數(shù)Mh (>90%)對(duì)氨芐西林、頭孢噻呋、青霉素和氟苯尼考敏感，對(duì)恩諾沙星和大觀霉素中介，對(duì)拖拉菌素耐藥。

5 多重耐藥的遺傳機(jī)制

上述表明BRD是主要細(xì)菌性病原體，特別是Mh的耐藥性正在增加，廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)Mh的分離也越來(lái)越普通。所以，問(wèn)題是只接觸一種藥物后，如何產(chǎn)生對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性?通常是水平基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了抗藥性的迅速增加。水平基因轉(zhuǎn)移有3種不同的方式：(1)通過(guò)轉(zhuǎn)化從環(huán)境中所謂的外源DNA中獲取基因;(2)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì);(3)通過(guò)獲取可移動(dòng)的遺傳元素[21-22]。雖然這3種機(jī)制都可以在獲得耐藥性中發(fā)揮作用，但在Mh和Pm中，多重耐藥(multidrug resistance，MDR)菌株增加的主要驅(qū)動(dòng)因素似乎是獲得一種稱為整合共軛因子(integrative conjugative element，ICE)的移動(dòng)遺傳元件[23]。ICE是整合到宿主染色體中的移動(dòng)遺傳元件，然后可以將它們繁殖并傳給后代，但也可以自我切割，以環(huán)狀中間體的形式復(fù)制，并通過(guò)Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到其他鄰近細(xì)胞，最終整合到新宿主的染色體中[22]。ICE中通常還帶有其他載體基因包括抗藥性基因，受體細(xì)胞正是隨著ICE轉(zhuǎn)移的這種方式迅速獲得了多種抗藥性基因[24]。

Mh和其他與BRD相關(guān)的巴氏桿菌科中已記錄了大量不同的ICEs。Pm(ICE-Pmu1)中鑒定出第一個(gè)攜帶四環(huán)素、氟苯尼考、磺酰胺、大觀霉素、恩諾沙星、替米考星和拖拉霉素抗性的ICE基因。 Eidam C等[25]在Mh 菌株42548中發(fā)現(xiàn)鑒定出第一個(gè)ICE基因是ICEMh1，該ICE基因比ICEPmu1長(zhǎng)但缺少一些基因，這些基因賦予了ICEPmu1對(duì)相同數(shù)量的抗藥性基因。

2014年Klima C L等[23]對(duì)來(lái)自Mh、Pm和Hs的25個(gè)ICEs進(jìn)行了鑒定。在采集自喬治亞州肉牛育肥場(chǎng)的Mh分離菌株中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)ICEs(命名為UGA1，UGA2，UGA3)，這些ICEs的長(zhǎng)度各不相同，但與ICEMh1和ICEPmu1具有同源性;ICEMh-UGA1和ICEMhUGA2的前1/4與ICEMh1相似，而其余3/4與ICEPmu1相似。此外，這些ICEs攜帶的所有抗性基因與存在于ICEPmu1中的相同，但I(xiàn)CEMh-UGA2中不含有floR基因(對(duì)氯霉素類藥物具有抗性的基因);與鑒定出的其他兩種ICE不同，ICEMh-UGA3僅攜帶tetH/R抗性基因復(fù)合體(該復(fù)合體編碼對(duì)四環(huán)素類抗生素的抗性基因)。

ICEs中存在的耐藥基因?qū)?duì)多種類型、具有抗菌作用的大量抗菌藥物產(chǎn)生抗性。在Mh分離株攜帶的β-內(nèi)酰胺抗性基因中，最常見(jiàn)的是blaOXA-2，其次是blaROB-1(盡管該基因攜帶在不依賴于ICE的質(zhì)粒上的可能性較大，就像最近發(fā)現(xiàn)的blaROB-2基因)[8,23,26-27]。所有這些編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因，不僅對(duì)經(jīng)典的青霉素類藥物，而且對(duì)較新的廣譜頭孢菌素類藥物都具有抗性[27]。已知所有這些基因均可傳遞對(duì)氨芐青霉素和青霉素的耐藥性，并可能增加頭孢噻呋的MIC[23,28]。不過(guò)，這些基因的存在可能不會(huì)自動(dòng)導(dǎo)致抗性，因?yàn)橐阎@些基因會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致基因失活的點(diǎn)突變[29]。

Mh和Pm對(duì)氯霉素類抗生素的耐藥性通常是由floR基因的存在引起的[23]。該基因編碼一種藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能主動(dòng)地將氯霉素類抗生素泵出細(xì)胞。然而在某些情況下，floR并不能使Mh和Pm產(chǎn)生完全的抗性而是將MIC調(diào)整到中間范圍，這可能是因?yàn)檫@些微生物中基因的活性降低。tet類基因是編碼四環(huán)素的最常見(jiàn)抗性基因，這些基因可調(diào)控外排泵將四環(huán)素主動(dòng)泵出細(xì)菌細(xì)胞。在Mh和Pm中，tetH、tetB、tetL和tetG是編碼這種泵的最常見(jiàn)基因，它們可以在質(zhì)粒和細(xì)菌染色體中找到[30]。但是在Mh和Pm的ICEs中僅發(fā)現(xiàn)并記錄了tetH基因[23,25]。在這些ICEs中通常還存在一個(gè)tetR基因(有時(shí)是重復(fù)的)，它充當(dāng)tet基因?qū)λ沫h(huán)素濃度敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[23,25,31]。

大環(huán)內(nèi)酯類藥物廣泛應(yīng)用處于高風(fēng)險(xiǎn)的BRD牛身上[32]。erm42、msrE和mphE基因是Mh和Pm ICE中最常見(jiàn)的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因，它們以不同的方式對(duì)這類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明erm42基因編碼一個(gè)單甲基轉(zhuǎn)移酶，該轉(zhuǎn)移酶在23S核糖體亞基上的A2058核苷酸處添加了一個(gè)甲基基團(tuán)，從而導(dǎo)致對(duì)林可酰胺類藥物的耐藥性，以及對(duì)低濃度大環(huán)內(nèi)酯類和鏈霉素類抗生素具有耐藥性。msrE基因編碼大環(huán)內(nèi)酯類外排泵，對(duì)14元和15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物如紅霉素、拖拉菌素和加米霉素產(chǎn)生耐藥性;然而，它不產(chǎn)生對(duì)16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性，如泰樂(lè)菌素、替米考星和泰地羅新。mphE基因是一種大環(huán)內(nèi)酯類磷酸轉(zhuǎn)移酶，在傳遞抗菌藥物耐藥性的方面與msrE具有相似的作用機(jī)制。隨著時(shí)間的推移，磺胺類藥物在治療牛病上的療效逐漸下降，伴隨著新抗菌藥物的出現(xiàn)其使用量越來(lái)越少。sul1和sul2基因是革蘭氏陰性菌對(duì)磺胺類藥物的主要耐藥基因，它們是通過(guò)編碼一種耐藥的二氫葉酸合成酶來(lái)起作用的。到目前為止，在Mh和Pm中僅發(fā)現(xiàn)sul2基因和ICE相關(guān)。ICE中存在的其他基因有aadA25、aadB、strA和strB以及aphA1，這些基因編碼對(duì)氨基糖苷類抗生素的抗性。aadA25(ant3〃)通過(guò)編碼氨基糖苷類O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)對(duì)氨基糖苷大觀霉素和氨基糖苷鏈霉素的耐藥性。aadB(ant2〃)也編碼氨基糖苷O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶，但對(duì)慶大霉素、妥布霉素、地貝卡星(Dibekacin)、西索米星(Sisomicin)和卡那霉素產(chǎn)生耐藥性。strA(aph3〃)、strB(aph6)和aphA1(aph3′)是抗性基因，其編碼修飾和使氨基糖苷失活的氨基糖苷O-磷酸轉(zhuǎn)移酶。strA和strB均對(duì)鏈霉素產(chǎn)生耐藥性，而aphA1則對(duì)卡那霉素、新霉素、巴龍霉素(paromomycin)、核糖霉素和利維霉素(lividomycin)產(chǎn)生耐藥性。

導(dǎo)致Mh分離菌株XDR株流行率上升的因素可能是攜帶多種基因，這些基因?qū)δ壳坝糜陬A(yù)防和治療BRD的大多數(shù)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。重要的是由于牛呼吸道病原體具有XDR的性質(zhì)，接觸一種抗菌藥物不再僅僅是選擇對(duì)這一種抗菌藥物的耐藥性。耐藥性現(xiàn)在是一種多藥現(xiàn)象，接觸一種抗菌藥物中會(huì)選擇對(duì)其他多種相關(guān)和不相關(guān)的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。關(guān)于BRD病原體耐藥性的另一個(gè)重要因素，就是耐藥性的增加很大程度上是由眾多MhXDR菌株所攜帶的ICE導(dǎo)致的[8]。抗菌藥物導(dǎo)致XDR菌株的擴(kuò)增和繁殖，以及隨后該菌株基因組中攜帶的所有基因和突變。因此，如果動(dòng)物被診斷出患有BRD并接受了一種特定的抗菌藥物治療，那么該動(dòng)物隨后不僅會(huì)攜帶對(duì)該抗菌藥物具有耐藥性的分離株，而且會(huì)對(duì)該動(dòng)物分離株ICE所攜帶的其他所有抗菌藥物具有抗性，因?yàn)椴煌幕蛑g存在聯(lián)系[7,9]。此外，由于XDR Mh菌株也含有對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的突變，盡管該基因/突變未攜帶在ICE上，但對(duì)此類抗菌藥物的仍將呈現(xiàn)耐藥表型[8,18]。重要的是，有新的證據(jù)表明這些菌株可能通過(guò)牛犢之間的接觸以及暴露于受污染的環(huán)境，在具有感染風(fēng)險(xiǎn)的牛群中傳播[8-9,16]。因此，了解XDR，重要的是不要僅僅局限于治療過(guò)的動(dòng)物;相反，有可能會(huì)在與治療動(dòng)物使用但從未接觸過(guò)抗菌藥物的動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)XDR克隆[16]。

6 抗菌藥物耐藥性對(duì)治療結(jié)果的影響

首次治療成功的定義是在第一次應(yīng)用抗菌藥物治療效果顯著的動(dòng)物比例。在大多數(shù)育肥牛飼養(yǎng)場(chǎng)中首次治療成功的比例都很高。通常，大于80%的首次治療成功比例被認(rèn)為是可以接受的。但是，Avra T D等[33]對(duì)引起治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行評(píng)估和回顧性研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)30%的牛對(duì)首次治療沒(méi)有反應(yīng)，而且暴露于高風(fēng)險(xiǎn)感染狀態(tài)比低風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)的犢牛首次治療失敗的可能性大。但是關(guān)于耐藥性對(duì)患BRD牛臨床預(yù)后的影響很少有人評(píng)估，Mcclary研究表明處于易受Mh分離株感染中的牛群 62%(n=688)對(duì)替米考星治療有反應(yīng)，但是38%(n=6)的牛攜帶耐藥菌株。

7 結(jié)語(yǔ)

在臨床治療中必須認(rèn)識(shí)到毒力因子和抗菌藥物耐藥性，并在制定以這些病原微生物為中心的治療和控制方案時(shí)考慮這些因素。盡管BRD對(duì)北美乃至世界養(yǎng)牛業(yè)具有重要意義，養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家包括我國(guó)在內(nèi)的研究人員很少有經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)的研究來(lái)評(píng)估引起B(yǎng)RD重要細(xì)菌性病原體的抗藥性。現(xiàn)在發(fā)表的多數(shù)文獻(xiàn)均是來(lái)自于經(jīng)過(guò)多次不同抗菌藥物治療的病死牛樣本中獲得實(shí)驗(yàn)診斷報(bào)告，且這些動(dòng)物已經(jīng)用多種不同的抗菌藥物進(jìn)行了多次治療。以Mh為例，總體趨勢(shì)表明，隨著時(shí)間的推移敏感性降低了，臨床耐藥菌株在逐漸增加。近年的研究表明，某些牛場(chǎng)中常見(jiàn)的抗菌藥物使用方法可能是促使耐藥克隆增加的主要因素。在科研人員做好流行病學(xué)、病原分離鑒定、致病機(jī)理、耐藥性與免疫防控研究的基礎(chǔ)上，廣大從事具體養(yǎng)殖的牧場(chǎng)主和從業(yè)人員，應(yīng)將重點(diǎn)放在養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全防控、減少應(yīng)激、增強(qiáng)免疫功能和抗菌藥物管理上，將有助于成功控制由這些微生物引起的疾病綜合征，減少由此產(chǎn)生的負(fù)面影響和經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第14篇

題目：豬流行性腹瀉病毒入胞機(jī)制研究現(xiàn)狀

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)α冠狀病毒(Alphacoronavirus)。該病毒主要感染豬腸道上皮，導(dǎo)致絨毛萎縮、吸收不良，引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水和高病死率。PEDV主要通過(guò)糞-口直接接觸傳播，也可形成氣溶膠并通過(guò)糞-鼻途徑傳播[1]。

豬流行性腹瀉在20世紀(jì)70年代后期首次出現(xiàn)在英國(guó)和比利時(shí)[2]。我國(guó)于1973年首次報(bào)道豬流行性腹瀉病例;隨后，包括韓國(guó)和日本在內(nèi)的其他亞洲國(guó)家也相繼暴發(fā)該病[2]。2010年10月之后我國(guó)開(kāi)始大規(guī)模暴發(fā)該病[2]。目前，PEDV已成為亞洲仔豬腹瀉的主要原因，是世界上最嚴(yán)重的豬病毒性疾病之一，給生豬行業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大影響，造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。

本文主要針對(duì)國(guó)內(nèi)外近期在PEDV的組織和細(xì)胞嗜性、細(xì)胞受體、入胞方式、細(xì)胞蛋白酶方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)PEDV的研究提供參考。

1 PEDV的組織和細(xì)胞嗜性

病毒在特異組織和細(xì)胞中的復(fù)制能力是決定其組織嗜性的重要因素。PEDV在腸道具有組織嗜性，哺乳豬感染急性PEDV的12 h～24 h內(nèi)，PEDV主要感染空腸和回腸，其次是空腸近端和十二指腸[3]。幽門不是急性PEDV感染的部位，而大腸的絨毛腸細(xì)胞經(jīng)常被感染，但感染的結(jié)腸上皮細(xì)胞無(wú)壞死病變。與結(jié)腸腸上皮細(xì)胞不同的是，PEDV感染的小腸絨毛腸上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生急性壞死并從固有層剝落，導(dǎo)致小腸中明顯的絨毛萎縮或融合[1]。PEDV可能不會(huì)在體內(nèi)誘導(dǎo)腸道絨毛腸細(xì)胞凋亡，但體外感染PEDV的非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)會(huì)發(fā)生凋亡[1]。

PEDV感染早期定位在小腸的絨毛-隱窩界面，而不是在絨毛尖端中。PEDV最先感染未成熟的腸細(xì)胞，隨后感染至空腸上部，直至感染整個(gè)空腸的絨毛上皮[1]。除了通過(guò)糞-口傳播，PEDV還能夠經(jīng)過(guò)鼻腔黏膜下的樹(shù)突狀細(xì)胞的攝取進(jìn)入鼻腔黏膜固有層，隨后攝取PEDV后的樹(shù)突狀細(xì)胞遷移至附近淋巴結(jié)，通過(guò)病毒突觸將PEDV傳遞給淋巴細(xì)胞，而后攜帶PEDV的淋巴細(xì)胞又能經(jīng)淋巴循環(huán)和血液循環(huán)遷移至腸黏膜，并將病毒傳遞給腸上皮細(xì)胞引起致病[3]。PEDV在體內(nèi)除主要感染豬小腸上皮細(xì)胞外，還感染杯狀細(xì)胞和隱窩干細(xì)胞[4]，也能夠在仔豬鼻腔上皮中進(jìn)行低水平復(fù)制[3]。

PEDV的S蛋白既具有受體結(jié)合能力又具有膜融合能力，S蛋白是決定組織和細(xì)胞嗜性以及宿主范圍的關(guān)鍵因素，但PEDV的細(xì)胞適應(yīng)性差。自PEDV發(fā)現(xiàn)以來(lái)，科研人員嘗試了很多方法將病毒適應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)。1984年宣華等首次報(bào)道了在胎豬腸組織單層細(xì)胞上培養(yǎng)PEDV，但因胎豬腸組織不易獲得，未得到廣泛應(yīng)用。直到1988年，Hofmann等通過(guò)向Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中添加胰蛋白酶，使PEDV成功適應(yīng)于Vero細(xì)胞。其后，日本和韓國(guó)也相繼報(bào)道PEDV在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)成功。我國(guó)李樹(shù)根、錢永清等也成功地在體外實(shí)現(xiàn)PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)。

目前PEDV的分離培養(yǎng)多數(shù)需要在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加胰蛋白酶，可能是由于蛋白酶在PEDV侵入細(xì)胞和細(xì)胞釋放PEDV病毒粒子方面起著重要作用。但是，不同來(lái)源的PEDV或Vero細(xì)胞適應(yīng)株對(duì)胰酶的抵抗力不一致，有的病毒經(jīng)過(guò)高代次傳代培養(yǎng)后已不具備胰酶依賴性。研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶通過(guò)將S蛋白切割為S1和S2亞基，使PEDV能夠在體外復(fù)制[5]。胰酶識(shí)別切割S蛋白的裂解位點(diǎn)在S2區(qū)的890位氨基酸，裂解后的S2可以促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞膜融合，利于病毒粒子的入侵[6]。隨后，PEDV可使受感染細(xì)胞裂解，導(dǎo)致細(xì)胞膜空泡化和合胞體形成[7]。

適應(yīng)Vero細(xì)胞的PEDV可以在不同種類的細(xì)胞系中增殖。Liu等將仔豬中分離的PEDV Ohi VBS2株在Vero CCL-81細(xì)胞中進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)，隨后用該細(xì)胞適應(yīng)的PEDV分別感染PK-15、豬睪丸細(xì)胞(swine testicle，ST)、人肝癌細(xì)胞(human hepatocellular carcinomas，Huh-7)、人胚肺成纖維細(xì)胞(human embryonic lung fibroblasts，MRC-5)、Vero CCL-81和蝙蝠肺細(xì)胞(bat lung，Tb1-Lu)等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vero CCL-81細(xì)胞適應(yīng)的PEDV可以感染上述細(xì)胞系，提示PEDV能夠感染豬源、猴源、人源及蝙蝠源的細(xì)胞系[8]。結(jié)合基因組進(jìn)化分析結(jié)果，推測(cè)PEDV可能來(lái)源于蝙蝠并且對(duì)包括人在內(nèi)的其他物種都有潛在的感染能力[8]。為探索新的培養(yǎng)方法，研究人員利用仔豬小腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell，IEC)成功分離了PEDV流行株，通過(guò)與Vero細(xì)胞對(duì)比發(fā)現(xiàn)病毒在添加胰酶的IEC上適應(yīng)細(xì)胞能力更強(qiáng)，并可以穩(wěn)定傳代[9]。推測(cè)可能是由于仔豬小腸上皮細(xì)胞是PEDV感染的宿主細(xì)胞，含有大量PEDV結(jié)合受體，例如pAPN等[10]。此外，IEC上的小腸宿主蛋白酶，可能具有類似胰酶的特性，可以促進(jìn)病毒的侵入和增殖，提高PEDV體外培養(yǎng)的適應(yīng)性。

2 PEDV的受體

病毒通過(guò)吸附、侵入、脫殼、合成、裝配、釋放等環(huán)節(jié)完成增殖，病毒黏附到細(xì)胞膜上是侵入宿主細(xì)胞的第一步，一般是與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合。冠狀病毒的受體包括多糖類受體和蛋白多肽類受體，其中多糖類受體又包括硫酸乙酰肝素和唾液酸。唾液酸有神經(jīng)氨酸 Neu5Gc、Neu5Ac、Neu5、9Ac2等;蛋白多肽受體有氨基肽酶N (aminopeptidase N，APN)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子-1(carcinoembryonic antigen-associated adhesion molecule 1， CEACAM1)和二肽酰肽酶4(dipetidyl peptidase 4，DPP4)等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，APN可能是PEDV的功能受體[8,10]，而Neu5Ac作為輔助受體發(fā)揮作用[8]。

氨基肽酶N(APN)是一種海馬型鋅-氨基肽酶，具有鋅離子依賴性，以頭對(duì)頭的同源二聚體形式錨定于細(xì)胞表面。APN的活性位點(diǎn)和肽結(jié)合通道位于一寬開(kāi)口的腔中，空腔可能會(huì)進(jìn)一步開(kāi)放，以結(jié)合暴露的蛋白質(zhì)N末端。活性位點(diǎn)錨定在肽/蛋白質(zhì)的N-末端中性殘基，并且肽結(jié)合通道以不依賴序列的方式結(jié)合其余的肽/蛋白質(zhì)。APN暴露的外表面可與冠狀病毒結(jié)合，但不會(huì)影響其生理功能，從而充當(dāng)冠狀病毒受體。哺乳動(dòng)物的APN多表達(dá)于腸上皮或神經(jīng)系統(tǒng)等組織的細(xì)胞表面，是一種具有多種功能的二聚體細(xì)胞表面胞外酶。

關(guān)于豬源APN(porcine aminopeptidase N，pAPN)是否為PEDV的受體，一直存在爭(zhēng)議。Li B X等[10]利用PEDV分別感染非易感細(xì)胞犬腎細(xì)胞(Madin-Daby canine kidney cells，MDCK)和過(guò)表達(dá)pAPN的MDCK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PEDV能夠在pAPN過(guò)表達(dá)的MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)，初步確定pAPN為PEDV的功能性受體。此外，通過(guò)建立表達(dá)pAPN的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其對(duì)PEDV易感，進(jìn)一步證明pAPN為PEDV的受體[12]。但是PEDV無(wú)法在天然表達(dá)pAPN的ST細(xì)胞中復(fù)制，而后者卻對(duì)TGEV非常敏感。因此，有人推測(cè)認(rèn)為，pAPN表達(dá)水平與PEDV感染之間可能存在相關(guān)性。進(jìn)一步研究表明，pAPN受體密度似乎是導(dǎo)致PEDV感染成功的重要因素[13]。Liu C等[8]利用PEDV S蛋白假病毒系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，該假病毒能感染表達(dá)人源APN(hAPN)或pAPN的非易感細(xì)胞MDCK，表明PEDV與APN的相互作用不具有物種特異性。而且，PEDV能感染豬、猴、人、蝙蝠等物種的細(xì)胞系[8]，也進(jìn)一步表明PEDV與APN的相互作用并不是特異的，提示PEDV可以跨物種傳播。

近年研究發(fā)現(xiàn)，hAPN和pAPN可能不是PEDV的主要功能受體，APN可能通過(guò)其蛋白酶活性促進(jìn)PEDV感染，但PEDV感染豬小腸上皮細(xì)胞可能與pAPN不相關(guān)[7,14]。另外，PEDV可以感染Vero細(xì)胞，但Vero細(xì)胞上的PEDV受體需要進(jìn)一步確認(rèn)。Ji C M等利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Vero細(xì)胞的APN基因后，發(fā)現(xiàn)APN敲除的細(xì)胞系與正常的Vero細(xì)胞感染效率相同，而且構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)綠猴APN的Vero細(xì)胞系感染PEDV的效率也未見(jiàn)增加，表明Vero細(xì)胞上可能存在其他類型的PEDV受體[7]。使用肝素作為競(jìng)爭(zhēng)劑，發(fā)現(xiàn)肝素預(yù)處理PEDV時(shí)，可有效地抑制PEDV感染Vero細(xì)胞的效果，推測(cè)硫酸乙酰肝素可能是PEDV感染Vero的黏附因子，也可能是Vero細(xì)胞對(duì)PEDV易感的原因之一。此外，Vero細(xì)胞本身是干擾素缺陷型細(xì)胞且具有抗高濃度胰酶的特性，也可能是PEDV易感的另一個(gè)原因，這也進(jìn)一步提示pAPN不是PEDV的唯一受體。因此，PEDV可能通過(guò)不同受體感染宿主細(xì)胞。

唾液酸是帶負(fù)電荷單糖，普遍存在于細(xì)胞膜表面，唾液酸有很多病毒結(jié)合糖蛋白和糖脂的唾液酸寡糖，由于細(xì)胞外表面上糖鏈中唾液酸分子的介導(dǎo)使病毒進(jìn)入細(xì)胞。除了APN，有研究表明PEDV S1的N末端具有唾液酸結(jié)合活性，S1 NTD與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合能增強(qiáng)病毒的感染性[15]。通過(guò)聚糖陣列篩選，發(fā)現(xiàn)Neu5Ac與PEDV S1的結(jié)合親和力最高[16]。然而，尚不知道唾液酸與S蛋白的結(jié)合如何影響PEDV進(jìn)入細(xì)胞。

3 PEDV入胞方式

多數(shù)病毒的表面蛋白能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞膜表面的受體，進(jìn)而介導(dǎo)病毒的入胞[11]。有囊膜的病毒能直接與細(xì)胞膜發(fā)生膜融合，進(jìn)而將病毒基因組釋放到宿主細(xì)胞質(zhì)中;多數(shù)囊膜病毒是通過(guò)宿主細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將病毒顆粒包裹在內(nèi)吞小體中并進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)吞小體中，病毒囊膜與內(nèi)吞小體的膜結(jié)構(gòu)在蛋白酶和低pH環(huán)境下發(fā)生病毒囊膜-內(nèi)體膜融合，使病毒基因組釋放到宿主細(xì)胞質(zhì)中。病毒利用的內(nèi)吞途徑包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨胞飲作用等。

2014年，Park J E等[17]利用化學(xué)抑制劑和共聚焦方法分析了PEDV侵入Vero細(xì)胞的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PEDV的入胞過(guò)程是在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用之后發(fā)生的，并且依賴于低pH才能成功進(jìn)入細(xì)胞。Wei X N等[18]用不同的PEDV亞型(PEDV GⅠ亞型GDS09株和GⅡ亞型GDS01株)分別感染Vero和IPEC-J2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PEDV可以通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入Vero和IPEC-J2細(xì)胞，而且不同亞型PEDV的侵入效率因內(nèi)吞途徑不同而不同。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同PEDV亞型之間的差異可能是由于S基因的差異，尤其是S基因的S1區(qū)(同源性約為92 %)與受體結(jié)合效率的不同而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入和膜融合效率的不同[19]，提示PEDV的刺突蛋白在介導(dǎo)不同方式的內(nèi)吞途徑中各有重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PEDV主要通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入內(nèi)吞小體，在低pH環(huán)境和組織蛋白酶L的水解作用下引發(fā)病毒表面蛋白構(gòu)象的改變，從而發(fā)生病毒囊膜-內(nèi)體膜融合以及病毒脫衣殼，釋放病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[19]。

關(guān)于PEDV侵入細(xì)胞的途徑，就目前研究結(jié)果來(lái)看，可能與豬德?tīng)査跔畈《镜娜肭址绞筋愃芠20]。一是內(nèi)吞途徑，通過(guò)宿主細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將病毒顆粒包裹在內(nèi)吞小體中并進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)吞小體中，病毒囊膜與內(nèi)吞小體的膜結(jié)構(gòu)在組織蛋白酶L、低pH環(huán)境下進(jìn)行融合，使病毒基因組釋放到宿主細(xì)胞質(zhì)中[19]。二是膜融合途徑，通過(guò)外源蛋白酶或宿主蛋白酶在病毒和受體結(jié)合后激活S蛋白，然后病毒通過(guò)膜融合方式進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。

4 蛋白酶在PEDV感染中的作用

蛋白酶在病毒感染中起關(guān)鍵作用，不同的病毒與不同的蛋白酶相互作用從而進(jìn)入細(xì)胞，這在某種程度上決定了病毒的侵入途徑。一般來(lái)說(shuō)，主要有4種細(xì)胞蛋白酶參與冠狀病毒的感染過(guò)程。

4.1 膜結(jié)合蛋白酶

大量研究表明，跨膜絲氨酸蛋白酶在病毒與細(xì)胞受體結(jié)合后介導(dǎo)病毒侵入。絲氨酸蛋白酶可以激活很多呼吸道冠狀病毒的感染過(guò)程。Shirato K等發(fā)現(xiàn)跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)可以顯著促進(jìn)PEDV在穩(wěn)定表達(dá)TMPRSS2的Vero細(xì)胞中釋放病毒粒子[21]。Shi W等[22]通過(guò)對(duì)Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族的TMPSS2、鱗癌細(xì)胞差異表達(dá)蛋白酶1(differentially expressed squamous cell carcinoma gene 1，DESC1)、呼吸道胰酶樣蛋白酶(human airway trypsin-like protease，HAT)和鑲嵌式長(zhǎng)型絲氨酸蛋白酶(mosaic serine protease large-form，MSPL)蛋白酶進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMPSS2和MSPL可與PEDV S蛋白進(jìn)行共定位，且這些蛋白酶可以裂解S蛋白、促進(jìn)病毒與細(xì)胞的融合。Shi等分別建立了穩(wěn)定表達(dá)TMPRSS2和MSPL的Vero/TMPRSS2和Vero/MSPL細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞系(尤其是Vero/MSPL)可以代替外源胰蛋白酶用于體外培養(yǎng)PEDV，它們通過(guò)激活PEDV S蛋白可以顯著提高病毒滴度，促進(jìn)病毒-細(xì)胞之間的融合[23]。

4.2 組織蛋白酶

病毒與細(xì)胞融合進(jìn)入內(nèi)吞體后，溶酶體組織蛋白酶L或組織蛋白酶B即可激活病毒侵入。組織蛋白酶對(duì)SARS-CoV-2、MERS、HCoV-229E、SARS等冠狀病毒均有激活作用[24-26]。利用PEDV S蛋白假病毒系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，PEDV侵入細(xì)胞并不依賴于前蛋白轉(zhuǎn)化酶或細(xì)胞表面蛋白酶，而是被溶酶體半胱氨酸蛋白酶(組織蛋白酶L和組織蛋白酶B)激活從而裂解S蛋白，促進(jìn)S蛋白包裝的假病毒粒子侵入宿主細(xì)胞[27]。同時(shí)，組織蛋白酶激活PEDV侵入的效果優(yōu)于胰蛋白酶，而當(dāng)組織蛋白酶被抑制或缺少時(shí)，胰蛋白酶則可以替代組織蛋白酶的作用，激活PEDV侵入[27]。

4.3 細(xì)胞外蛋白酶

胰蛋白酶是一種消化酶，主要分布在小腸中，可直接裂解許多腸道冠狀病毒的S蛋白，因此，對(duì)PEDV侵入具有一定的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)PEDV毒株都高度依賴胰蛋白酶。當(dāng)病毒與其受體結(jié)合時(shí)，胰蛋白酶可切割結(jié)合的PEDV S蛋白，而游離病毒顆粒不會(huì)被裂解[28]。這些發(fā)現(xiàn)表明，PEDV S蛋白在與受體結(jié)合并被外源胰蛋白酶切割后可能發(fā)生構(gòu)象變化，從而誘導(dǎo)膜融合[28]。有研究表明，胰蛋白酶識(shí)別S蛋白的裂解位點(diǎn)為S2區(qū)的890位氨基酸，S蛋白的裂解可以促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞膜融合，利于病毒粒子的入侵[6]。但是一些PEDV的Vero細(xì)胞適應(yīng)株在感染細(xì)胞時(shí)并不需要胰蛋白酶，而病毒出芽階段經(jīng)胰蛋白酶處理可在感染的細(xì)胞中引起明顯的細(xì)胞病變作用，導(dǎo)致感染的Vero細(xì)胞形成合胞體，在此過(guò)程中胰蛋白酶可以增強(qiáng)其感染性和CPE的形成[28-30]。

4.4 前蛋白轉(zhuǎn)化酶

弗林蛋白酶(Furin)是一種前蛋白轉(zhuǎn)化酶，位于反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)(Trans Golgi Network，TGN)中，也存在于細(xì)胞表面。弗林蛋白酶可以裂解具有特定基序的前體蛋白，以產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的成熟蛋白。該酶可以在PEDV的S1/S2位點(diǎn)上切割S蛋白，這種切割對(duì)于S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合和宿主細(xì)胞入侵至關(guān)重要。研究人員通過(guò)將PEDV S蛋白中的第888位氨基酸(V888)突變?yōu)楦チ值鞍酌缸R(shí)別的裂解位點(diǎn)(VQKR→RQKR)，構(gòu)建融合肽N端帶有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的重組PEDV毒株P(guān)EDV-SFCS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV-SFCS可在培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制，且不依賴胰蛋白酶，但是重組病毒的滴度較低[31]。表明宿主蛋白酶可能具有替代胰蛋白酶的潛力，如果能合理利用可以使得PEDV體外培養(yǎng)無(wú)需胰蛋白酶。

5 展望

PEDV刺突蛋白S決定了病毒的多樣性和宿主嗜性，并介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的表面特異性受體結(jié)合和病毒-細(xì)胞膜融合過(guò)程;S蛋白還與PEDV的體外生長(zhǎng)適應(yīng)情況和體內(nèi)毒力衰減有關(guān)。隨著PEDV突變株的不斷產(chǎn)生，PEDV的入胞過(guò)程可能進(jìn)化出多種機(jī)制，而且PEDV可能對(duì)包括人類在內(nèi)的其他物種構(gòu)成潛在威脅。值得注意的是，PEDV進(jìn)入宿主細(xì)胞的途徑可能與所使用的細(xì)胞系和環(huán)境條件也有一定關(guān)聯(lián)，因此，利用豬腸小體建立的PEDV感染模型有可能會(huì)更好的模擬PEDV體內(nèi)感染的過(guò)程[32-33]，而如何提高PEDV體外培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性，進(jìn)而提高病毒滴度，是研究者們關(guān)注和急需解決的重要問(wèn)題之一。因此，構(gòu)建不依賴于胰蛋白酶的通用的PEDV細(xì)胞系，對(duì)于PEDV的分離培養(yǎng)、病毒生物學(xué)研究，防御病毒感染至關(guān)重要。對(duì)于PEDV S蛋白與pAPN受體的深入研究將有助于更好地了解病毒入胞機(jī)制。PEDV入胞機(jī)制的深入研究，也將為靶向入胞途徑的抗病毒藥物設(shè)計(jì)提供靶點(diǎn)，并為PEDV的防控提供了新的思路和方向。

動(dòng)物醫(yī)學(xué)論文范文 第15篇

題目：兔斯氏艾美耳球蟲(chóng)病研究進(jìn)展

兔球蟲(chóng)病是由艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲(chóng)寄生于兔的腸道或膽管上皮細(xì)胞內(nèi)引起的一種寄生蟲(chóng)病。隨著規(guī)模化養(yǎng)兔的發(fā)展，兔球蟲(chóng)病的危害在近些年逐步顯現(xiàn)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展造成很大影響。在目前公認(rèn)的感染兔的11種艾美耳球蟲(chóng)中，斯氏艾美耳球蟲(chóng)(E.stiedai)致病性較強(qiáng)、危害較大，且是唯一寄生在兔肝膽管上皮細(xì)胞內(nèi)的兔球蟲(chóng)。

1 病原形態(tài)特征

斯氏艾美耳球蟲(chóng)卵囊一般為長(zhǎng)卵圓形或近似橢圓形，卵囊大小為36.4 μm(31.3 μm～38.7 μm)×22.8 μm(19.1 μm～27.8 μm)，卵囊指數(shù)為1.59，不同地區(qū)分離株大小有一定差異[1]。卵囊一般呈淡黃或橘黃色，在較小一端往往呈削平狀或凹陷，卵囊壁非常薄、整體上光滑均厚，成熟卵囊內(nèi)沒(méi)有外殘?bào)w，有些卵囊存在散在顆粒狀外殘?bào)w，但因?yàn)殒咦幽业恼趽醵茈y被看到。孢子囊為長(zhǎng)卵圓形，一端有斯氏體，內(nèi)殘?bào)w明顯。子孢子的寬端有一折光體位于核后，呈球形，約占子孢子縱長(zhǎng)的1/3～2/5。

2 生活史

斯氏艾美耳球蟲(chóng)是少數(shù)幾種寄生在肝臟膽管上皮細(xì)胞內(nèi)的球蟲(chóng)之一，它的發(fā)育過(guò)程可分為裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖3個(gè)階段。家兔食入孢子化卵囊后，經(jīng)過(guò)腸道中膽汁和胰酶的作用，子孢子從卵囊中逸出，進(jìn)入腸固有層淋巴管、腸系膜淋巴結(jié)，然后通過(guò)乳糜池進(jìn)入血液循環(huán)，隨著肝動(dòng)脈流入膽管周圍毛細(xì)血管叢并由此處侵入膽管上皮細(xì)胞。

子孢子鉆入上皮細(xì)胞后，很快擴(kuò)大變成裂殖體，經(jīng)過(guò)多次分裂后形成許多裂殖子。這些裂殖子從死亡的上皮細(xì)胞中溢出，繼續(xù)侵襲新的上皮細(xì)胞。在裂殖生殖階段，Pellerdy L P等曾提出有5代或6代，裂殖體可分為A、B兩型或三型。國(guó)內(nèi)一般將裂殖生殖劃分為4代，并首次提出肝球蟲(chóng)裂殖生殖具有多態(tài)現(xiàn)象，即裂殖體以多態(tài)方式產(chǎn)生下代裂殖子，包括子孢子型裂殖體、雙核或多核的裂殖子型裂殖體、單核裂殖子型裂殖體和經(jīng)典型裂殖體。經(jīng)過(guò)多次無(wú)性繁殖，裂殖子會(huì)分裂發(fā)育成兩性配子。兩性的大小配子發(fā)育成熟后，小配子進(jìn)入大配子結(jié)合為合子，合子外面迅速包上被膜后形成卵囊并隨糞便排出體外。

剛從糞便中排出的卵囊還未孢子化，不能感染家兔。經(jīng)過(guò)適宜的溫度、濕度和氧氣濃度的誘導(dǎo)，可發(fā)育成為具有感染力的孢子化卵囊。孢子化的完成意味著卵囊已具備感染力，過(guò)去曾經(jīng)認(rèn)為斯氏體的出現(xiàn)是孢子化完成的標(biāo)志，但后來(lái)通過(guò)鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，在子孢子發(fā)育早期即出現(xiàn)斯氏體，因此將子孢子的可分辨度及折光體的出現(xiàn)作為孢子化完成的標(biāo)志比較合理。

3 流行病學(xué)

各種品種和不同年齡的兔都可感染斯氏艾美耳球蟲(chóng)，但以1月齡～3月齡的兔最易感而且病情嚴(yán)重，死亡率高。該病一年四季均可發(fā)生，陰雨季節(jié)多發(fā)，均呈地方性流行。斯氏艾美耳球蟲(chóng)病在我國(guó)分布范圍很廣，重慶、甘肅、海南、河北、河南、青海、江蘇、山東、陜西、浙江、新疆等地均有報(bào)道。

4 致病性

患病的家兔通常表現(xiàn)出精神不振，食欲減退，動(dòng)作遲緩，伏臥不動(dòng)等癥狀。繼續(xù)發(fā)展會(huì)出現(xiàn)鼻腔、眼部分泌物及唾液分泌增多，并出現(xiàn)貧血、黃疸及腹瀉，虛弱消瘦，生長(zhǎng)停滯。嚴(yán)重病例有時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，站立不穩(wěn)，四肢麻痹，病程較短，很快死亡[2]。剖檢發(fā)現(xiàn)感染嚴(yán)重的家兔肝臟高度腫大，肝臟表面及實(shí)質(zhì)內(nèi)有黃豆大小的沿膽小管分布的白色或淡黃色結(jié)節(jié)。對(duì)結(jié)節(jié)病灶進(jìn)行鏡檢，可以看到各個(gè)發(fā)育階段的球蟲(chóng)，肝實(shí)質(zhì)發(fā)生局部壞死。膽管增生變大，管壁明顯增厚，膽管內(nèi)充滿暗綠色膽汁，鏡檢可見(jiàn)到大量卵囊及脫落的上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)感染斯氏艾美耳球蟲(chóng)后丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性升高，總蛋白、球蛋白、總膽紅素含量升高[3]。也有學(xué)者檢測(cè)了斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染兔的血常規(guī)、肝功能和凝血4項(xiàng)等血液指標(biāo)，肝功能指標(biāo)與其他學(xué)者的結(jié)果基本一致，還發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶顯著增高，血清膽堿酯酶顯著降低[4]。對(duì)人工感染斯氏艾美耳球蟲(chóng)后不同時(shí)間段血清中丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)感染初期丙二醛含量明顯升高，超氧化物歧化酶活性有明顯下降，但后期可逐漸恢復(fù)至正常水平，表明感染所致的病理氧化應(yīng)激可通過(guò)肝臟代償維持[5]。

肝球蟲(chóng)的感染造成肝細(xì)胞的損傷和壞死，影響肝臟的分解、合成、生物轉(zhuǎn)化及排泄功能，使得機(jī)體的代謝功能出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致家兔死亡。在一定的數(shù)量范圍內(nèi)，家兔吞食的卵囊數(shù)越多，表現(xiàn)出的病理變化越明顯[6]。

5 診斷方法

5.1 卵囊漂浮檢測(cè)

改進(jìn)的飽和食鹽水漂浮法，只取1粒糞便，加飽和食鹽水?dāng)嚢韬筮^(guò)濾進(jìn)青霉素瓶中，用吸管從液面前后左右中5個(gè)方向吸取表面糞液滴加于帶凹槽的載玻片上鏡檢。檢測(cè)出了包含斯氏艾美耳球蟲(chóng)在內(nèi)的7種球蟲(chóng)，可節(jié)省取樣時(shí)間，操作簡(jiǎn)便[7]。

5.2 組織病理學(xué)檢測(cè)

病理變化主要發(fā)生在肝臟，肝臟腫大并有結(jié)節(jié)病灶，鏡檢可觀察到肝臟組織變性壞死，肝膽管上皮增生，可見(jiàn)大量不同發(fā)育階段的蟲(chóng)體[8]。

5.3 血清學(xué)檢測(cè)

Rose M E 采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)感染斯氏艾美耳球蟲(chóng)病家兔血清中的抗體，最早可在感染后3 d～7 d檢測(cè)到補(bǔ)體結(jié)合滴度的增加。Abu-El-Ezz N M T等[9]采用卵囊計(jì)數(shù)、組織病理學(xué)和ELISA進(jìn)行診斷，發(fā)現(xiàn)使用卵囊抗原檢測(cè)抗體的ELISA可在感染后1周檢測(cè)到抗體，是早期診斷肝球蟲(chóng)病的最佳方法。

魏聞芮等[10]建立了一種以斯氏艾美耳球蟲(chóng)MIC-1和MIC-3重組蛋白為抗原診斷肝球蟲(chóng)病的間接ELISA方法，敏感性和特異性都非常高，感染后第6、8、10天均能檢測(cè)到相應(yīng)的抗體。

5.4 分子生物學(xué)檢測(cè)

Oliveir U C等[11]建立了一種基于ITS1序列作為靶標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)鑒別診斷11種兔球蟲(chóng)病的方法，種間無(wú)交叉反應(yīng)，敏感性可達(dá)0.8個(gè)～1.7個(gè)孢子化卵囊。

閆文朝等[12-13]成功克隆了斯氏艾美耳球蟲(chóng)完整的 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 序列，并以該序列為目的基因，建立了能有效檢測(cè)出50個(gè)斯氏艾美耳球蟲(chóng)卵囊的靈敏性高、特異性強(qiáng)的PCR檢測(cè)方法。還以此為基礎(chǔ)建立了用于區(qū)分和鑒定斯氏艾美耳球蟲(chóng)病、腸艾美耳球蟲(chóng)病和黃艾美耳球蟲(chóng)病的多重PCR診斷方法。

汪運(yùn)舟等[14]建立了基于全基因組擴(kuò)增技術(shù)的兔球蟲(chóng)單卵囊PCR技術(shù)，能夠在單個(gè)卵囊的水平上進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定，從而大大提高PCR反應(yīng)的靈敏度。

Hassan K M等[15]提取了感染家兔糞便、全血樣本、肝組織的DNA，基于ITS1序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)最早可在感染后12 d從肝組織中檢測(cè)到PCR陽(yáng)性。

梁子平等[16]以球蟲(chóng)ITS1基因?yàn)榉N屬特異性檢測(cè)的PCR分子靶標(biāo)，針對(duì)兔源11種艾美耳球蟲(chóng)病建立了多重PCR聯(lián)檢方法,對(duì)檢測(cè)目標(biāo)表現(xiàn)出了高敏感性和高特異性。該多重PCR聯(lián)檢方法平均最低可檢測(cè)到大約0.8個(gè)～1.7個(gè)的孢子化卵囊。

溫福利等[17-18]根據(jù)E.stiedaiITS1區(qū)域的基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可檢出含1個(gè)卵囊DNA的樣本，適用于感染初期的定量檢測(cè)。還根據(jù)E.stiedai的ITS1-5.8sRNA-ITS2 基因序列設(shè)計(jì)特異引物，建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法，對(duì)待檢樣本進(jìn)行10倍稀釋后，仍能夠檢測(cè)到36 copies/mL的DNA樣本，具有特異性和較高的敏感性。

6 免疫學(xué)

用免疫組化鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法對(duì)斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染后家兔體內(nèi)球蟲(chóng)抗原的分布進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)肝臟竇狀隙、膽管上皮細(xì)胞、肝門淋巴結(jié)和脾臟內(nèi)有明顯的棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)，說(shuō)明這些區(qū)域和部位有相應(yīng)的E.stiedai抗原存在，且抗原數(shù)量最多的是肝臟，其次為脾臟，肝門淋巴結(jié)最少[19]。試驗(yàn)證明，斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染家兔后可以激發(fā)體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的特異性抗體能夠作用于卵囊抗原和糞便抗原，抗體水平高低能夠說(shuō)明保護(hù)性免疫應(yīng)答水平的高低。

6.1 活疫苗

不同劑量的γ射線輻射可以不同程度地降低斯氏艾美耳球蟲(chóng)的致病性，45 krad的γ射線輻射劑量仍不能使孢子化卵囊致死。雖不能使接種動(dòng)物發(fā)病，但能使動(dòng)物感染，刺激機(jī)體產(chǎn)生相當(dāng)程度的免疫保護(hù)力。

有學(xué)者用超聲處理的卵囊免疫家兔，發(fā)現(xiàn)免疫組的卵囊產(chǎn)出要低于未免疫組，而血清抗體水平則高于未免疫組[20]。

6.2 亞單位疫苗

Hanada S等用從感染兔的膽汁中提取的裂殖體抗原免疫無(wú)球蟲(chóng)兔，發(fā)現(xiàn)免疫兔的膽管周圍聚集較多的炎性細(xì)胞，而蟲(chóng)體較少，排卵量也少于未免疫的兔。Omata Y等用感染15 d后膽汁中的子孢子和裂殖體抗原免疫兔后再攻蟲(chóng)，免疫組卵囊排出數(shù)量比對(duì)照組少。Abdel K N等用糞抗原加弗氏佐劑免疫接種無(wú)球蟲(chóng)兔后，經(jīng)口攻毒孢子化卵囊。結(jié)果顯示，免疫組排出的卵囊數(shù)量減少，體液免疫應(yīng)答水平也比對(duì)照組高，可以提供70%的免疫保護(hù)力。

6.3 疫苗候選基因與基因工程苗

有學(xué)者成功將微線蛋白和肌動(dòng)蛋白解聚因子基因進(jìn)行克隆并在真核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，也有學(xué)者原核克隆表達(dá)了菱形體蛋白、熱休克蛋白、天冬氨酸蛋白酶基因并進(jìn)行了Western blot分析[21-26]。

有研究者構(gòu)建了微線蛋白與白介素IL-15共表達(dá)真核載體，并轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門菌，免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，該重組菌能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗球蟲(chóng)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，抗球蟲(chóng)指數(shù)達(dá)到160以上，具有中等抗球蟲(chóng)效力[27]。

7 藥物治療

由于還沒(méi)有研究出商品化疫苗，目前斯氏艾美耳球蟲(chóng)病的防控主要依靠藥物，妥曲珠利、地克珠利、α-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸、莫能菌素、鹽霉素、馬杜拉霉素、拉沙洛菌素等都在臨床中有應(yīng)用。

趙愛(ài)云等[28]觀察了3種抗球蟲(chóng)藥對(duì)斯氏艾美耳球蟲(chóng)病的敏感性，結(jié)果表明，球蟲(chóng)血痢散(主要成分為磺胺喹噁啉)的增重效果較好,但是不能很好地抑制卵囊排出;球蟲(chóng)血痢清(主要成分為鶴虱、檳榔、雷丸等14種中藥)在增重和抑制卵囊排出這兩方面效果都比較好;試驗(yàn)蟲(chóng)株已經(jīng)對(duì)兔血痢靈(主要成分為鹽酸氯苯胍)產(chǎn)生了一定的耐藥性。

Al-Mathal E M[29]觀察了橄欖科植物沒(méi)藥(Commiphoramolmol)對(duì)兔肝球蟲(chóng)病的治療效果，發(fā)現(xiàn)沒(méi)藥的商業(yè)化提取物Mirazid和天然產(chǎn)物都可以降低卵囊排出量，最終達(dá)到治愈的效果，但Mirazid更高效。

Baghdadi H B等[30]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)黑種草(NigellasativaL.)的種子混懸劑和油乳劑是一種安全有效的治療斯氏艾美耳球蟲(chóng)病的藥物。

王璽德等[31]通過(guò)試驗(yàn)證明灌服石榴皮水提物后，家兔排出的斯氏艾美耳球蟲(chóng)卵囊的比重顯著減少;飼喂鹽酸氯苯胍的家兔，排出卵囊的比重也減少。

宋宏曉等[32]對(duì)比了癸氧喹酯與妥曲珠利對(duì)斯氏艾美爾球蟲(chóng)病的治療效果，發(fā)現(xiàn)在平均增重、卵囊排出量、病變記分方面，兩組差異顯著，妥曲珠利效果優(yōu)于癸氧喹酯。

Indrasanti D等[33]發(fā)現(xiàn)大蒜提取物對(duì)斯氏艾美耳球蟲(chóng)的卵囊形成有一定抑制作用。

蘭家花[34]在一份感染斯氏艾美耳球蟲(chóng)家兔的診治報(bào)告中，采用氯苯胍按每千克精料加100 mg混合均勻;磺胺六甲氧嘧啶，按每千克精料加1 g混飼1周并配合飼養(yǎng)管理，用藥3 d～5 d后患兔病情開(kāi)始好轉(zhuǎn)，用藥2個(gè)療程后，未見(jiàn)幼兔死亡，疫情得到有效控制。

Eladl A H等[35]使用商業(yè)化的植物提取物Herba Cox?治療人工感染斯氏艾美耳球蟲(chóng)病的家兔，感染前7 d到感染后28 d連續(xù)使用，可以減輕臨床癥狀，改善肝臟功能，減少卵囊排出，是一種新型安全高效的治療方法。

從以上研究可以看出，對(duì)于抗斯氏艾美耳球蟲(chóng)病藥物的研究，有從傳統(tǒng)化學(xué)藥物轉(zhuǎn)向天然草本藥物、從治療為主轉(zhuǎn)向預(yù)防為主的趨勢(shì)。

8 展望

目前對(duì)斯氏艾美耳球蟲(chóng)病的防控仍是以藥物防治為主，疫苗研究尚未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，還沒(méi)有商業(yè)化疫苗問(wèn)世。但是，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，更多的疫苗候選基因?qū)⒈缓Y選評(píng)估，相信不久的將來(lái)就可以研制出安全高效的基因工程疫苗，給養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)福音。

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